蔡玉刚，米 兰，吴永富，邹多生，黄叙金，王燕军,*，代 勇,*

(1.泸州市公安局刑事科学技术研究所，四川 泸州 646000；2.四川省公安厅刑侦局，成都 610041；3.四川警察学院，四川 泸州 646000）

氟胺酮[1](F-ketamine)，系北京大学王世玉教授等人于1987年设计并合成的苯环己哌啶类衍生物。经动物实验验证[2]，氟胺酮与氯胺酮类似，属于N-甲基-D-天门冬氨酸受体抗拮剂，具有分离性麻醉作用，长期使用具有成瘾性。由于有关部门对氯胺酮的监管力度加大，不法分子将氟胺酮作为替代药物进行非法销售、滥用。据执法部门污水毒情监测数据显示[3]，广西、江苏等地氟胺酮滥用情况，在苯环己哌啶类毒品所占比例已由2018年的10%增长至2020年的80%，成为除海洛因和甲基苯丙胺以外滥用最多的毒品，且有向其他地方迅速蔓延的趋势，带来了较多的社会问题。

目前，对氟胺酮报道文献较少[4-6]，仅有少量案例及结构确证的数据，对氟胺酮及其代谢物去甲氟胺酮的组织分布和代谢降解规律未见报道。因此，本文建立生物检材中氟胺酮及代谢物去甲氟胺酮的高效液相色谱-三重四极杆质谱检测方法，并通过动物实验，研究对大鼠灌胃给药后，氟胺酮和去甲氟胺酮在大鼠体内各组织分布情况及血液中的降解规律，为进一步揭示氟胺酮及去甲氟胺酮的体内分布特征提供理论依据，为氟胺酮的体内检验及体内代谢降解过程研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

仪器：Agilent 6470高效液相色谱－三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司）；AL204-IC型分析天平（瑞士Metlle Toledo公司）；Milli-Q Direct 8超纯水机（美国Millipore公司）；Dionex ASE350型快速溶剂萃取仪（美国 Thermo Fisher Scientific公司)；CV600冷冻真空浓缩仪（北京吉艾姆公司）。

试剂：氟胺酮（≥99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司），去甲氟胺酮（1 mg/mL，美国Cerilliant公司），乙酸乙酯、甲醇、乙腈（色纯谱，美国Fisher公司），甲酸（色谱纯，德国Merck公司）。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（3.0 mm×150 mm×1.8 μm）；流动相：A相，0.1%甲酸-水溶液；B相，乙腈。柱温：30 ℃；流速：0.5 mL/min；进样量：1 μL；梯度洗脱条件：B相初始浓度为5%，在2 min由5%增加到20%并保持6 min，在8 min由20%增加到30%并保持0.5 min，在8.5 min由30%增加到95%并保持1.5 min，整个检验过程用时10 min。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：10 mL/min；雾化器压力：40 psi；屏蔽气：氮气，气体温度380 ℃，流量12 mL/min；毛细管电压：4 000 V。检测方式：多反应监测（MRM）扫描。

1.3 样品制备与提取

取待测血液0.2 mL或者匀浆后的组织0.5 g放于研钵中，加入1.0 g（组织中加入2.0 g）硅藻土混匀研磨至颗粒状，装入5.0 mL的萃取池中，在萃取柱温100 ℃，萃取压为1.034×104kPa条件下，静态萃取5 min后，用乙酸乙酯∶氨水（97∶3，体积比）4.0 mL作为萃取剂，用快速溶剂萃取提取两次，合并冲洗液至10 mL离心管中，置于30 ℃冷冻真空浓缩仪在转速为600 r/min条件下浓缩至1.0 mL左右后，加入1.0 mL甲醇，涡旋振荡混匀1 min，将液体转移至2 mL进样瓶中，然后置于50 ℃冷冻真空浓缩仪（300 r/min）上吹干，用200 μL甲醇涡旋振荡溶解，过0.22 μm膜（Nylon），待检。

1.4 工作曲线溶液制备

取空白全血0.2 mL和各匀浆后的空白组织液0.5 g，分别添加氟胺酮和去甲氟胺酮均配成0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL(ng/g)空白添加样，分别按照1.3中的方法提取后检测，以待测物浓度为横坐标，以待测物峰面积为纵坐标，分别建立血液、各组织工作曲线，并分别得出工作曲线方程及相关系数。

1.5 动物实验模型建立

40只雌雄各半SD大鼠（由西南医科大学动物实验中心提供）随机分为四组，体重200g±10g，每组10只，禁食12 h后，第一组一次性灌胃给药0.045 mg/kg（参照氯胺酮临床70 kg成年人静脉注射单次使用剂量一般不超过0.5 mg/kg，按体表面积系数6.3换算）的氟胺酮，分别在0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72、96、120、144、168、192、216 h经大鼠尾静脉采血0.2 mL；第二组作为血液空白对照组与第一组相同时间取血0.2 mL；第三组一次性灌胃给药0.045 mg/kg的氟胺酮1 h（预实验血液平均浓度最高后半小时）后立即处死，第四组作为内脏空白组与第三组同时处死，立即解剖取脑、心脏、肝、肺、肾、脾、血液、肌肉，按照1.3方法进行样品处理，并按照1.2实验条件进行检验。

以上动物实验已通过西南医科大学实验动物伦理委员会审查。

1.6 数据分析

数据运用SPSS16.0进行统计分析。

2 结果

2.1 萃取条件优化

本研究采用的前处理方法为快速溶剂萃取，而影响萃取率的因素有：萃取压力、萃取温度、静态萃取时间、萃取次数及萃取溶剂种类及容量。萃取溶剂在大气压下均为液态，在萃取温度下，萃取池内的压力远远高于大气压，且萃取压力对目标药物的溶解度影响不大，故选用仪器默认压力1.034×104kPa。由于药物的溶解度与温度有密切关系，本文考察了80、100、120 ℃温度下药物的回收率，实验证明，在100 ℃时两种药物的回收率最高。对静态萃取时间和萃取次数的考察中，静态萃取5 min，萃取2次，能达到萃取效果最好且效率最高。由于氟胺酮为碱性药物，本实验萃取条件均采用溶剂加氨水的碱性体系进行，笔者考察了乙腈∶氨水（97∶3，体积比）、甲醇∶氨水（97∶3，体积比）、三氯甲烷∶氨水（97∶3，体积比）、乙酸乙酯∶氨水（97∶3, 体积比）。实验表明，4.0 mL乙酸乙酯∶氨水（97∶3，体积比）作萃取溶剂时，药物的回收率最高，因此选择乙酸乙酯∶氨水（97∶3, 体积比）做萃取剂。

2.2 LC-MS/MS条件优化

2.2.1 色谱柱的选择

本文考察了Agilent SB C18 Aq（2.1 mm×50 mm×1.8 μm）、Agilent SB C18 RRHD（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）、Agilent EclipsePlus C18 RRHD（3.0 mm×150 mm×1.8 μm）三种色谱柱，在1.2的仪器条件下Agilent EclipsePlus C18 RRHD 对两种药物的分离效果、峰形最好，如肝组织色谱图（图1）可见，氟胺酮和去甲氟胺酮的保留时间分别为：4.892和4.751 min。

2.2.2 流动相的选择

实验考察了乙腈和甲醇两种有机相体系对氟胺酮及去甲氟胺酮色谱峰形的影响。结果表明，在甲醇体系中氟胺酮及去甲氟胺酮响应较高，但呈强基质效应，重现性不好；在乙腈体系中，氟胺酮及去甲氟胺酮响应较低，但重现性好，故选择乙腈作为有机相。在0.1%甲酸水流动相中加入乙酸铵，氟胺酮和去甲氟胺酮的峰形及响应均无较大变化，故选择0.1%甲酸水为水相体系。

2.2.3 质谱条件的优化

用1.2.1的色谱条件，将5 ng/mL 氟胺酮及去甲氟胺酮的标准品溶液，进行母离子全扫描，确定氟胺酮分子离子为m/z222.0，再将分子离子作为母离子进入二级质谱，产生了两个响应最高的子离子m/z109.0、163.0，选择两个丰度较高的特征子离子对进行测试，然后以响应高、峰形好的离子对作为定量离子对，最终选择丰度最高的m/z109.0子离子作为定量离子对，选择m/z163.0子离子为定性离子对；去甲氟胺酮的分子离子为m/z208.0，产生的两个响应最高的子离子m/z109.0、191.0，选择响应高的m/z109.0子离子作为定量离子对，选择m/z191.0子离子为定性离子对。两种药物的裂解电压及碰撞能参数见表1。

表1 氟胺酮及代谢物保留时间、MRM离子及碰撞能(CE)Table 1 Retention time and MRM conditions for F-ketamine and its metabolite

2.3 线性范围和检出限考察

根据实验可见，各样本中氟胺酮和去甲氟胺酮在0.02~200.0 ng/mL（ng/g）之间相关系数均在0.992 2以上，线性良好。线性方程、相关系数及最低检出限见表2。

表2 氟胺酮及代谢物在各组织中线性方程、线性范围、最低定量限及最低检出限Table 2 Linear equations, linear ranges, LOQs and LODs of F-ketamine and its metabolite

2.4 回收率及精密度考察

实验表明， 0.5、5、50 ng/mL（ng/g）三个浓度的氟胺酮和去甲氟胺酮在各生物样本中的日内和日间（48 h）精密度良好，回收率高（见表3）。

表3 生物样本中氟胺酮及代谢物的回收率及精密度(n=5)Table 3 Recovery and precision of F-ketamine and its metabolite in biological samples (n=5)

2.5 血液中氟胺酮及代谢物的降解规律

实验数据表明，氟胺酮经灌胃进入大鼠体内后，血液中的氟胺酮在0.5 h内达到最大浓度，迅速代谢为去甲氟胺酮，在1 h时衰减为0.5 h浓度的33.5%，随后逐渐衰减，在4~8 h之间血液浓度达到一个相当于0.5 h浓度7.4%的平衡浓度，在120 h时出现一个相当于0.5 h浓度9.1%的峰值，随后逐渐减少。去甲氟胺酮在0.5 h内亦达到最大浓度，随后逐渐衰减，在2 h出现一个相当于0.5 h浓度43.1%的峰值，在120 h和144 h出现一个相当于0.5 h浓度27.9%和11.2%左右的峰值，随后逐渐减少。结果见图2。

2.6 大鼠组织中氟胺酮及代谢物的分布

氟胺酮进入大鼠体内0.5 h，氟胺酮和去甲氟胺酮血液浓度达到最高值，并迅速分布各个组织（见表 4、图 3）。

表4 氟胺酮及代谢物在大鼠组织中的含量分布（ng/mL, ng/g）Table 4 Distribution of F-ketamine and its metabolite in rat tissues

3 讨论

3.1 大鼠模型的建立

氟胺酮进入体内后经肝代谢为活性产物去甲氟胺酮，氟胺酮和去甲氟胺酮均系苯环己哌啶衍生物，属于N-甲基-D-天门冬氨酸受体抗拮剂，进入体内后阻断大脑的联络径路和丘脑向新皮层的投射，抑制丘脑和新皮质系统，选择性阻断痛觉冲动的传导，使痛觉消失，同时又能兴奋脑干及边缘系统，引起意识模糊（分离性麻醉），从而产生幻觉[7]。与氯胺酮中毒症状相似[8]，少量摄入产生意识和感觉的分离状态，导致神经中毒反应和精神分裂症状，表现为幻觉、运动功能障碍，出现怪异和危险行为，大剂量摄入出现抑制呼吸，甚至使呼吸停止的情况。由于氟胺酮未被临床使用，其用量参数在国内外文献未见报道，本实验氟胺酮给药量参考氯胺酮成人临床剂量，经体表面积换算公式换算，以灌胃的形式进行。

预实验中以单次0.045 mg/kg的剂量对大鼠灌胃后，大鼠出现身体抖动、步态蹒跚、对声音刺激性反射，36 h内排尿量明显减少，部分出现无尿现象。文献报道[9]，氯胺酮在给药后15 min达到血液最高浓度，而氟胺酮系氯胺酮的Cl位被F取代，由于F的电位较Cl低，氟胺酮与机体结合较氯胺酮较慢，实验数据表明，氟胺酮进入大鼠体内后30 min内达到血液最高浓度，代谢物去甲氟胺酮在30 min以内亦达到最高浓度，经预实验对不同时间点处死的大鼠进行的体内药物浓度检测，在1 h时各组织中均能检出，故确定1 h为大鼠处死时间。

3.2 氟胺酮及代谢物在大鼠体内的降解规律

根据实验结果，在给药后监测的10 d中，大鼠的血液中均能检出氟胺酮和去甲氟胺酮。氟胺酮血液浓度在4~8 h出现一个平衡浓度，在120 h 出现一个降低后的峰值，去甲氟胺酮的血液浓度在6~8 h出现一个平衡浓度，在2、120、144 h分别出现降低后的峰值，这些平衡浓度和二次峰值的出现是药物摄入方式导致还是其他原因造成有待进一步研究。

3.3 氟胺酮及代谢物在大鼠体内分布

实验结果可见，氟胺酮在各组织中分布特点为：血＞肝＞脾＞肾＞肌肉＞脑＞肺＞心脏；去甲氟胺酮在各组织中分布特点为：血＞肝＞肾＞肺＞脾＞肌肉＞心脏＞脑。在给药1 h后，氟胺酮很快分布于各个器官，且含量较高，说明氟胺酮蛋白结合率低，脂溶性高，可迅速通过血液到达各器官；氟胺酮及去甲氟胺酮在血液中的含量远远高于脏器，说明氟胺酮和去甲氟胺酮的血溶性较强；其次氟胺酮和去甲氟胺酮在肝中含量是脏器中最高，可能是因为主要由肝脏代谢；肾含量仅次于肝，说明氟胺酮主要由肾脏排泄和可能是肾小管的二次吸收造成肾脏药物浓度较高。

在相同时间，各组织中去甲氟胺酮浓度均高于氟胺酮浓度，除脾以外的脏器尤为明显，由此可见，氟胺酮进入体内大部分被代谢为去甲氟胺酮。据文献报道[10]，苯环己哌啶类药物，一般经肝脏P450酶CYP3A4代谢为活性物质N-去甲产物，其活性效能是原药的1/3左右，进一步代谢为脱氢去甲产物，主要经肾脏排出体外。实验表明，脾脏中氟胺酮和去甲氟胺酮的含量较为相近，脾脏对药物的滞留性原因待进一步研究。氟胺酮的代谢过程，待下一步动态检测研究。

4 结论

本文建立的快速溶剂萃取/高效液相色谱-三重四极杆质谱检验方法，适用于生物样品中氟胺酮和去甲氟胺酮的检验。

该方法速度快、操作简单、检出限低、回收率高和重现性好，对建立的药用量氟胺酮动物模型中氟胺酮及代谢物去甲氟胺酮在体内分布情况进行测定，并对氟胺酮及代谢物在血液中的降解规律进行了监测，获得了相关的毒理学和代谢降解规律实验数据，为相关案件的检材采集、处理、检验提供了科学依据。