周裕贵，孙竹林，宋亚军，牟 荣，张平平，杨瑞馥，

鼠疫属于人兽共患的自然疫源性疾病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病，在历史上曾发生过的3次世界性大流行，给人类带来深重的灾难。近些年来鼠疫病例主要集中于非洲[1]，但现代交通对传染病的快速传播以及我国自然疫源地的存在，使得鼠疫仍对我国人民健康存在巨大的潜在威胁。鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)是鼠疫的病原体。鼠疫菌的荚膜抗原即F1(fraction 1)抗原的抗原性和特异性较好，因此抗F1抗体是鼠疫疫苗研制和免疫诊断的重要靶标。但F1抗原的提取和纯化较困难，不利于鼠疫抗体检测方法的建立。

基于上转发光免疫层析(up-converting phosphor technology based later flow assay, UPT-LF)的检测方法，采用上转发光颗粒(up-converting phosphor particles，UCP)作为免疫层析的新型标记物[2]，具有灵敏度高和不易受干扰等特点。此前，我们基于双抗原夹心模式建立了以鼠疫抗体为检测靶标的UPT-LF方法，即在分析膜和结合垫上均使用了依照《中国生物制品规程》收录方法制备的F1抗原。由于此F1抗原可能不是该方法的最适抗原，其灵敏度较差。因此，本研究重新收集了另3种来源的F1抗原，即分别为依据生物制品规程优化方法制备的F1抗原、依据文献提取的F1抗原[3]和重组F1抗原，将其用于优化基于上转发光免疫层析检测鼠疫抗体的方法，并进行优化后评价。首先用基于间接检测模式的酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法评价了4种F1抗原的效价，并将依据《中国生物制品规程》收录方法改进制备的F1抗原免疫家兔制备了相应的兔抗F1抗体；然后以该兔抗F1抗体作为质控品，将4种F1分别用于分析膜和结合垫的制备并两两组合制备多种试纸，进行UPT-LF方法适用抗原的筛选，优化了UPT-LF鼠疫抗体检测方法；使用F1抗原疫苗接种者血清和各种鼠疫菌株兔免血清进行评价，并使用全菌免疫获得的兔多抗和羊多抗将UPT-LF和ELISA方法进行了灵敏度比较。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究所用的F1抗原共有4种，重组F1抗原(简称为“rF1”)、依据2000年版的《中国生物制品规程》收录的制备方法进行制备的天然F1抗原(简称为“F1-1”)、对《生物制品规程》收录的方法进行改进获得的天然F1抗原(简称为“F1-2”)(简称为“F1-2”)、军事医学研究院提取的天然F1抗原(简称为“F1-3”)。本研究中所用的兔抗F1-2多抗、兔抗EV76多抗、羊抗EV76多抗均为军事医学研究院微生物流行病研究所未知病原分析微生物研究室制备；兔抗EV76和羊抗EV76多抗是指使用鼠疫菌EV76株分别全程免疫大耳白兔和绵羊后获得血清，并经硫酸铵沉淀初步纯化的多抗。 F1抗原亚单位疫苗接种者的血清、F1免疫兔血清来源于兰州生物制品所。鼠疫菌EV株(CMCC52006)兔免血清、鼠疫菌O614F株兔免血清、鼠疫菌Tjiusidej(R)株(CMCC52010株)兔免血清、鼠疫菌201株兔免血清来自中国食品药品检定研究院，以上血清均按照中华人民共和国卫生行业标准《鼠疫诊断标准》(WS279-2008)中的ELISA方法进行了滴定。

1.2 间接ELISA法评价不同F1抗原 使用含有1%酪蛋白的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)，将F1免疫兔血清稀释为1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶12 800、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800；将3株兔抗EV76多抗、1株羊抗EV76分别稀释为1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.6和7.8 μg/L，稀释完备用。

用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.05 mol/L, pH 9.6)稀释F1抗原至终浓度1 mg/L，以100 μL/孔加至酶联板上，4 ℃过夜包被，移除液体后拍干；每孔加入200 μL 0.1%干酪素，37 ℃封闭2 h，移除液体后拍干。加入100 μL上述稀释的血清或抗体，37 ℃孵育30 min。使用含有0.5‰的Tween的0.1 mol/L 的磷酸盐缓冲液(PBS)进行清洗后拍干。加入HRP-二抗(羊抗兔; 兔抗羊)，反应20 min，清洗拍干。最后加入反应底物TMB后显色，终止反应后测定D值。本研究中ELISA的阈值(即cutoff)统一设定为0.2。

1.3 兔抗F1-2抗体的制备 将1 mL F1抗原和1 mL佐剂混合乳化后，在大耳白兔的腹股沟皮下(共4处)注射。前3次免疫的间隔时间为2周，剂量分别为200 μg、400 μg和800 μg；第4次免疫时无佐剂，剂量为1 mg。第4次免疫7 d后，使用戊巴比妥安乐处死大耳白兔。采用颈动脉放血法收集的兔血清，并用正辛酸-饱和硫酸铵法提取血清中的多抗。使用终浓度1 mg/L的4种F1抗原包被的酶联板，测试免疫各阶段的血清及多抗的效价。

1.4 UPT试纸的优化 以兔抗F1为C带，以不同的F1抗原作为检测带(T带)，以UCP-F1抗原为结合垫，优化基于双抗原夹心的UPT鼠疫抗体检测方法。将本研究制备的兔抗F1-2以2 g/L的终浓度包被于硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)膜作为质控(control，C)带，将2.5 g/L的rF1，F1-1、F1-2和F1-3分别包被于NC膜作为检测(test，T)带，制作4种分析膜。将rF1、F1-1、F1-2和F1-3分别和UCP偶联，BSA封闭后，将偶联物喷洒于玻璃纤维上，37 ℃烘干制作成四种结合垫。将以上分析膜和结合垫分别配对，组合为16种试纸。从16组试纸中选出9组，使用正常兔血清和健康人血清分别稀释兔抗F1-2进行测试。测试时，将正常兔血清(或健康人血清)与样品处理液以1∶9比例混合，取100 μL上样检测，检测结果作为阴性对照；将兔抗F1-2多抗使用正常兔血清(或健康人血清)稀释为10 mg/L和1 mg/L作为阳性样本, 同样与样品处理液以1∶9比例混合，取100 μL上样检测。 阳性样本中含抗F1抗体，加样后首先被UCP-F1抗原捕获形成UCP-F1抗原-抗F1抗体复合物，此复合物和UCP-F1抗原继续向吸水垫侧涌动，前者被T带捕获形成固相F1抗原-抗F1抗体-F1抗原-UCP复合物，后者被C带捕获形成固相兔抗F1抗体-F1抗原-UCP复合物，T带和C带因均含UCP的复合物的存在而形成信号；阴性样本只在C带形成特异性信号。T带和C带信号的比值，即T/C值，定义为UPT-LF的检测值。计算每组试纸的阳性样本的T/C值(positive，简称P)与阴性对照血清T/C值(negative，简称N)的差值再与N的比值，即(P-N)/N，比较试纸的检测效果。挑选(P-N)/N 值最优组，确定鼠疫抗体检测方法的原料，并将该条件建立的UPT检测方法称为YPAb-UPT-LF。

1.6 UPT试纸的覆盖度评价 选用F1抗原亚单位疫苗接种者的血清、鼠疫菌EV株(CMCC52006)兔免血清、鼠疫菌O614F株兔免血清、鼠疫菌Tjiusidej(R株)(CMCC52010)兔免血清和鼠疫菌201株兔免血清，评价YPAb-UPT-LF的覆盖度。所有阳性血清样本均用健康人血清稀释10倍或100倍后，将样本与样品处理液以1∶9比例混合，取100 μL上样检测。

1.7 与ELISA的对比 将500 μL健康人血清和4.5 mL样品处理液混合作为样本稀释液，将F1免疫兔血清进行1∶10、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶12 800、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800和1∶409 600倍比稀释；将兔抗EV76多抗-3稀释为终浓度为1 000、500、250、125和62.5 μg/L的待测液体；将羊抗EV76多抗稀释为终浓度为500、250、125和62.5 μg/L的液体，取100 μL上样于UPT-LF试纸，进行YPAb-UPT-LF检测。在实际应用中，样本需用样本处理液进行10倍稀释后再进行YPAb-UPT-LF检测，因此将各血清和多抗的终浓度提高10倍表示各浓度下YPAb-UPT-LF的实际检测结果。

2 结 果

2.1 不同F1抗原的评价 将4种F1抗原，即重组F1、生物制品规程中的方法F1-1、规程改良方法F1-2和依据文献方法提取的F1-3，按照1 mg/L的浓度包被，使用ELISA法评价其对兔血清(含兔抗F1-2多抗)、3株兔抗EV76多抗和1株羊抗EV76多抗。结果显示，4种F1抗原包被条件下的ELISA检测，均能对全菌免疫的兔多抗、全菌免疫的羊多抗以及F1免疫的兔血清具有较高检测值，表明抗原性良好(图1和表1)。其中，rF1和F1-3的效果稍好于另两种F1抗原，这也是接下来能使UPT-LF检测方法灵敏度更优的两种抗原。

A为F1免疫兔血清的检测值； B、C、D为3株兔抗EV76多抗的检测值；E为1株羊抗EV76的检测值。图1 ELISA法评价4种F1抗原Fig.1 Evaluation of four F1 antigen by ELISA method

表1 4种F1抗原包被的ELISA分别测定F1免疫兔血清和几种EV76多抗的检测结果Tab.1 Anti-F1 rabbit serum titers and several anti-EV76 polyclonal antibodies titers determined by ELISA methods coated with four F1 antigen

2.2 兔抗F1抗体的制备 选用《生物制品规程》收录的方法制备改进获得的天然F1抗原，即F1-2，免疫大耳白兔制备兔抗F1抗体，4次免疫剂量分别为200、400、800 和1 000 μg。第2次和第3次免疫后的血清效价分别为1∶51 200和1∶102 400。纯化后的兔抗F1-2抗体，使用rF1、F1-1、F1-2、F1-3包被的酶联板进行测试，其ELISA效价分别为62.5、62.5、62.5和31.25 μg/L，表明多抗质量良好。此多抗后续用于UPT试纸质控带的制备，并用做UPT-LF鼠疫抗体检测方法的质控品。

图2 本研究制备的兔抗F1-2的ELISA效价Fig.2 Rabbit anti-F1-2 polyclonal antibody titers determined by ELISA

2.3 UPT试纸的优化 以rF1、F1-1、F1-2和F1-3分别作为T带包被抗原制备分析膜，同时这4种抗原分别和UCP颗粒偶联制备结合垫，将这些分析膜和结合垫进行两两组合制备16种试纸，使用兔抗F1-2多抗测试，进行UPT适用抗体的初筛。根据测试结果从16组试纸中选出9组，以正常兔血清或健康人血清用样品处理液稀释10倍后上样检测的结果作为阴性对照。将兔抗F1-2分别用正常兔血清或健康人血清稀释至终浓度为1 mg/L和10 mg/L后，再用样品处理液稀释10倍进行测试，计算每组试纸的阳性T/C值(简称P)与阴性T/C值(简称N)的差值再与N的比值(即(P-N)/N)，其值越大表明阳性样本的T/C值和阴性样本的T/C值的差异越大，即相应试纸的灵敏度越好。结果表明，当结合垫中为UCP颗粒和rF1的偶联物，而分析膜上为F1-3蛋白时，其灵敏度最好(图3)。本研究将其作为优化后的UPT方法，将其命名为YPAb-UPT-LF。YPAb-UPT-LF可检出血清样本中1 mg/L兔抗F1抗体质控品。

M代表分析膜，P代表结合垫。正常兔血清(A)和健康人血清(B)系列稀释兔抗F1-2多抗的UPT检测结果图3 4种F1抗原分别作为UPT-LF方法中的包被或标记蛋白的检测结果Fig.3 Detection results of UPT-LF with four F1 antigens as the coated or labeled antibody for the strips, respective

在图3中，结合垫中与UCP颗粒偶联的蛋白和分析膜中的蛋白均为F1-1的条件，为未优化之前的UPT-LF方法，其对质控品的灵敏度仅为10 mg/L。这表明UPT-LF检测方法经优化后灵敏度提高了10倍。

以健康人血清为样本，经样品处理液10倍稀释后，使用YPAb-UPT-LF进行10次测试，将10次测量的平均值加3倍的标准差，作为试纸的cutoff值。T/C值高于cutoff值的待测样本被判定为阳性样本，反之为阴性样本。经计算，YPAb-UPT-LF的cutoff值为0.25(图4)。以下研究中所有待测阳性血清样本均用健康人血清稀释10倍或100倍，然后再用试剂的样品处理液稀释10倍后进行YPAb-UPT-LF测试。对于系列稀释的阳性样本，将高于cutoff值的最低浓度值定义为YPAb-UPT-LF的检测灵敏度。

2.4 YPAb-UPT-LF覆盖度评价 健康人血清10倍或100倍稀释F1抗原亚单位疫苗接种者的血清以及多种鼠疫菌菌株[EV株(CMCC52006)、O614F株、Tjiusidej(R)株(CMCC52010)和201株]免疫兔血清，再用样品处理液稀释10倍后，使用YPAb-UPT-LF检测。YPAb-UPT-LF对用健康人血清100倍稀释后的各阳性样本检测T/C值均高于cutoff，为弱阳性结果；而对用健康人血清10倍稀释后的各阳性样本可获得强阳性检测结果(图4)。这表明YPAb-UPT-LF方法具有良好的检测覆盖度。

图4 YPAb-UPT-LF的检测覆盖度Fig.4 The coverage of YPAb-UPT-LF for detection of various serum

2.5 与ELISA比较 挑选已经ELISA评价的F1免疫兔血清、兔抗EV76多抗-3和羊抗EV76，使用YPAb-UPT-LF方法检测，并对ELISA和YPAb-UPT-LF的灵敏度进行比较。结果表明，YPTAb-UPT-LF对F1免疫兔血清、兔抗EV76多抗-3和羊抗EV76灵敏度分别为1∶40 960、1.25 mg/L、0.625 mg/L。与表1中的间接ELISA法测得的效价相比，YPAb-UPT-LF的灵敏度分别差2～4倍，40倍、2.5～5倍，见图5。但是因为YPAb-UPT-LF对样本的处理存在10倍稀释的操作，而ELISA方法对样本的处理未包含10倍稀释的操作，所以YPAb-UPT-LF和间接ELISA法的实际检测能力基本持平。

系列稀释的F1免疫兔血清(A)、兔抗EV76多抗-3(B)和羊抗EV76多抗(C)的YPAb-UPT-LF检测结果(即T/C值)。图5 YPAb-UPT-LF对F1多抗和全菌抗体的检测评价Fig.5 Evaluation of YPAb-UPT-LF for detection of antibodies against F1 or the whole cell of Y. pestis

3 讨 论

F1抗原是鼠疫菌诊断和亚单位疫苗研究的重点，其结构早在2003年得以解析[4]。虽然常以多聚体形式存在于鼠疫菌的表面，单个F1抗原仅有170个氨基酸组成，且除去21个前导肽后仅有149个氨基酸，其分子量为15.5 kDa，等电点为4.3[5]。F1抗原存在于菌体和上清中，其中大部分存在于菌体上，因此纯化的F1抗原较难获得，这给鼠疫抗体检测项目带来较大的阻碍。因此，尽管基于上转发光检测鼠疫菌抗原的方法已经比较成熟[2,6-8]，但基于上转发光检测鼠疫抗体的方法因受限于F1抗原而导致其灵敏度偏差。

本研究从多家单位获取了多种方法制备的F1抗原，对基于上转发光免疫层析检测鼠疫抗体方法进行优化，结果发现分析膜和结合垫中分别使用依据文献提取的F1抗原和重组F1抗原的上转发光免疫层析方法(YPAb-UPT-LF)，其灵敏度10倍优于未被优化之前的UPT方法(即在分析膜和结合垫中均使用依据生物制品规程提取的F1抗原的UPT方法)。优化后的YPAb-UPT-LF检测覆盖度良好，能够对F1抗原亚单位疫苗接种者的血清、多种鼠疫菌菌株免疫的兔血清进行检测。实际上，UPT是一种定量方法，如果有相应的鼠疫抗体标准品，可以依据F1抗体浓度和T/C值的对应关系绘制标准定量曲线，从而实现对鼠疫抗体的定量检测。但目前国内缺少相应的标准品(而国际的鼠疫相关产品处于不共享状态)，且无已获审批的定量检测试剂作为参照，因此本研究仅仅给出了相应浓度的各样本的T/C值，并选用了能进行半定量检测的ELISA方法作为对比。

血清中的成分较复杂，容易对检测造成比较严重的干扰，所以需要前处理减少干扰。YPAb-UPT-LF只需将待检血清样本使用样品处理液进行10倍稀释，即可对血清中的F1抗体进行检测，整个检测过程小于20 min。虽然ELISA方法因操作步骤较复杂而不适用于现场检测，但因为具有对未结合靶标进行清洗的步骤，ELISA只需对血清样本进行对倍稀释或不稀释处理即可进行检测，因此其灵敏度较高[9-10]。尽管ELISA方法在检测下，免疫兔血清、免抗EV76多抗-3和羊抗EV76时，灵敏度分别为YPAb-UPT-LF检测同种物质的2～4倍、40倍、2.5～5倍，但是YPAb-UPT-LF含对样本进行10倍稀释的操作，因此，YPAb-UPT-LF和ELISA的实际灵敏度基本持平。

本研究中的兔抗F1抗体质控品仅进行了硫酸铵沉淀的初步纯化，因此YPAb-UPT-LF对其检测灵敏度仅为1 mg/L。考虑到10倍稀释和100 μL上样的操作，YPAb-UPT-LF可以检测100 μg/L的兔抗F1抗体(每个试纸条上的多抗仅为10 ng)，其灵敏度较好。

本研究通过对多种来源的F1抗原进行筛选，优化了上转发光免疫层析检测鼠疫抗体方法，并用质控品、F1疫苗接种者血清、多种鼠疫菌株的兔免血清进行了评价，对其他鼠疫抗体检测方法的优化和评价来说具有一定的参考价值。本研究针对鼠疫抗体检测的YPAb-UPT-LF进行优化，为鼠疫的免疫诊断和F1疫苗免疫效果评估等工作提供了一个备选的方法。

致谢：感谢中国食品药品检定研究院魏东老师为本研究提供的各种鼠疫菌株兔免血清，感谢兰州生物制品所王秉翔老师、军事医学研究院周冬生老师为本研究提供的天然F1抗原和重组F1抗原。

利益冲突：无

引用本文格式：周裕贵，孙竹林，宋亚军，等. 基于上转发光免疫层析检测鼠疫抗体方法的优化与评价[J].中国人兽共患病学报，2022，38(7)：582-588. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.075