刘碧玉 周伟靓 福建省农产品质量安全检验检测中心 福州 350003

氟苯尼考（Forfenicol，FF）是广泛应用于畜牧业生产环节的酰胺醇类药物，因氟苯尼考与多西环素（DOX）的复方制剂经临床试验证明可显著提高禽类养殖过程中生存质量及存活率， 增加养殖户经济效益。 目前， 检测禽类肌肉中氟苯尼考药物残留的方法主要有高效液相色谱荧光检测法、 液相色谱-串联质谱法和酶联免疫法。 由于酶联免疫法仅适用于初筛和快检，基于氟苯尼考残留确证定量检测，本试验以拟建立的高效液相色谱荧光检测法和液相色谱-串联质谱法为禽类肌肉质量控制 （氟苯尼考残留）提供基础支撑。

1 材料和方法

1.1 高效液相色谱荧光检测法

1.1.1 仪器和试剂 2695 高效液相色谱仪，沃特世Waters 科技有限公司；ACQUITY UPLC BEH-C18色谱柱，沃特世Waters 科技有限公司；电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；AR3130 电子天平，奥豪斯（上海公司）；D-37520 高速冷冻离心机，美国科俊仪器有限公司；N-EVAP 112 氮吹仪，美国Organomation 有限公司；MS3 digital 涡旋混匀器，德国IKA 有限公司。 氟苯尼考标准品，含量为99.8%，购自Dr.Ehrenstorfer 公司； 优级纯甲醇、 色谱纯乙腈、色谱纯正己烷，均购自默克股份两合公司；分析纯乙酸乙酯，国药集团化学试剂有限公司；色谱纯甲酸，美国阿拉丁工业公司。

1.1.2 检测方法与步骤

1.1.2.1 标准品溶液配制 称取氟苯尼考标准品10 mg（精密称定，标准品含量为99.8%），置100 mL棕色容量瓶中， 加色谱纯乙腈定容至刻度， 配制成100 μg/mL 标准储备溶液，-20 ℃冰箱保存。

取1 mL 标准储备溶液于100 mL 棕色容量瓶中，用色谱纯乙腈定容至刻度，配制成1 μg/mL 标准工作溶液，-20 ℃冰箱保存。

取1 mL 标准工作溶液于10 mL 棕色容量瓶中，用色谱纯乙腈定容至刻度，配制成100 ng/mL 标准溶液，临用前现配。

1.1.2.2 样品中氟苯尼考有效成分提取 称取2.0 g（精确到0.001 g） 均质的禽肉样品于50 mL 离心管中，加色谱纯乙腈15 mL，加入一颗均匀子，涡动提取1 min，8 000 r/min 离心5 min， 提取液转移至50 mL 离心管中，重复提取一次，合并提取液，50 ℃下氮吹近干，加2 mL 水使残渣溶解，加入5 mL 色谱纯正己烷， 涡旋提取1 min， 静置分层或8 000 r/min 离心5 min，弃掉上层的正己烷层，再加5 mL 色谱纯正己烷， 涡旋提取1 min， 静置分层或8 000 r/min 离心5 min，弃掉上层的正己烷层，取下层清液过0.22 μm 滤膜，上机测定。

1.1.2.3 高效液相色谱条件 BEH -C18 柱（2.1 mm× 150 mm，5 μm）或相当者；流动相：水:甲醇=75:35； 流速：1 mL/min； 柱温：40 ℃； 进样量：10 μL；测定波长：230 nm。

1.2 液相色谱-串联质谱法

1.2.1 仪器和试剂 超高效液相色谱/气相色谱串联质谱仪，Waters 沃特世科技（上海）有限公司；Waters TQ-S UPLC/MS/MS BEH-C18 柱，Waters 科 技有限公司；电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；AR3130 电子天平，奥豪斯（上海公司）；D-37520 高速冷冻离心机， 美国科俊仪器有限公司； N-EVAP 112 氮吹仪， 美国Organomation 有限公司；MS3 digital 涡旋混匀器， 德国IKA 有限公司。 氟苯尼考标准品， 含量为99.8%， 购自Dr.Ehrenstorfer 公司；优级纯甲醇、乙腈、正己烷，均购自默克股份两合公司；分析纯乙酸乙酯，国药集团化学试剂有限公司； 优级纯甲酸， 美国阿拉丁工业公司。

1.2.2 试验方法与步骤

1.2.2.1 标准溶液配制 混合标准工作液的配制：精密量取标准储备液 （同高效液相色方法）0.1 mL，置100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到1 μg/mL 混合标准工作液。 精密量取1 μg/mL 混合标准工作液1 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到100 ng/mL 混合标准工作液。

1.2.2.2 样品前处理 准确称取5.0 g （精确至0.01 g）均质的禽肉或禽蛋样品于50 mL 离心管中，加入15 mL 乙酸乙酯和0.5 mL 氨水， 涡旋提取1 min，8 000 r/min 离 心5 min， 上 清 液 转 入 另 一50 mL 离心管中； 重复提取一次， 离心后合并上清液，取6 mL 上清液到15 mL 离心管中，50 ℃氮吹近干，待净化。

用1 mL 0.5%甲酸乙腈/水溶液复溶，涡旋30 s，加入5 mL 饱和正己烷，涡旋1 min，弃去上层正己烷；重复操作3 次，取下层清液过0.22 μm 滤膜后上机测定。 同法做样品空白试验。

1.2.2.3 质谱条件 扫描方式： 多反应离子监测（MRM）；离子源：电喷雾离子源（ES+）；离子源温度：150 ℃； 离子源喷雾电压：3.0 kV ES+； 雾化温度：550 ℃；雾化气流速：900 L/h；锥孔气流速：150 L/h。

2 结果与对比分析

2.1 标准曲线 分别量取（1 00 ng/mL） 标准溶液0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL 和2.00 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中， 用流动相定容至刻度，混匀， 配 制 成 浓 度 为0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 和200 ng/mL 的标准溶液，上机测定，绘制标准曲线（见图1-图2）。 在样品中添加一定量的混合标准使用液， 按HPLC 和LC-MS/MS 方法要求进行样品前处理，分别上高效液相色谱仪和超高效液相色谱/气相色谱串联质谱仪检测，按称样量计，对相应浓度定量限进行计算。计算线性方程、线性范围、相关系数、检出限与定量限，从表1 可见， 氟苯尼考标准溶液在5～200 ng/mL 具有良好的线性关系， 高效液相色谱荧光检测法相关系数为0.9993， 液相色谱-串联质谱法相关系数为0.9991；高效液相色谱荧光法检出限为10 μg/kg、 定量限30 μg/kg，液相色谱-串联质谱法检出限为5 μg/kg、定量限10 μg/kg， 高效液相色谱荧光检测法与液相色谱-串联质谱法均能达到氟苯尼考残留检测要求。

图1 HPLC 标准曲线

图2 LC-MS/MS 标准曲线

表1 线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

表2 平行测定样品的加标回收率

2.2 样品检测和加标回收率 选取市售鸭肉、鸡肉各一份， 按照高效液相色谱荧光检测法与液相色谱-串联质谱法进行样品处理、测定，均未检出氟苯尼考残留。按方法要求称取样品，分别加入5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg 标准溶液，每个浓度水平做6 个平行测定， 按照两种方法要求进行样品前处理、测定，从表2 可见，高效液相色谱荧光检测法的样品加标回收率为82.0%～92.0%，液相色谱-串联质谱法为90.0%～100.0%；高效液相色谱荧光检测法的相对标准偏差为1.34%～3.78%， 液相色谱-串联质谱法为1.95%～3.68%。 可见，高效液相色谱荧光检测法与液相色谱-串联质谱法相关试验表现均符合氟苯尼考药物残留检测要求。

3 结 论

高效液相色谱荧光检测法与液相色谱-串联质谱法的样品加标回收率分别为82.0%～92.0%、90.0%～100.0%，相对标准偏差（RSD）均小于5%，达到相关检测标准要求，适用于氟苯尼考在禽类肌肉药物代谢动力学的研究。 高效液相色谱仪已较为普及，禽类肌肉样品处理操作工序相近的情况下，使用高效液相色谱荧光检测法，干扰因素较少，在不具备液相色谱-串联质谱法试验条件的地区或单位，高效液相色谱荧光检测法的试验结果同样具有参考价值， 为检验条件相对落后的地区或单位在畜牧业的药物代谢动力学及其他应用研究提供基础性试验支撑。