王启宇, 杨 敏, 魏环宇, 吴治兴, 赵娅红, 吕怡颖, 卢 超,刘佳妮, 柯艳果, 余 磊*, 黄飞燕*

(1. 昆明学院农学院, 云南省都市特色农业工程技术研究中心, 昆明 650214;2. 云南农业大学植物保护学院, 昆明 650201)

魔芋是天南星科Araceae 魔芋属Amorphophallus多年生草本植物[1],是目前已知植物中唯一能大量提取葡甘聚糖(KGM)的植物[2-4]。KGM作为一种优质可溶性膳食纤维,具有极佳的成膜性,黏弹性及高效吸附性等特性[5-6]。因此,魔芋在医药、保健及石油化工等领域具有极大的开发应用前景[7-9]。珠芽魔芋Amorphophallusbulbifer是近几年西南地区主推的优质种质资源。相比于传统魔芋,珠芽魔芋不仅可以用地下部块茎和实生种子繁殖,也可以通过叶柄分叉处着生的气生珠芽繁殖,这一特性使其在繁殖系数、产量质量、经济效益等方面更具推广价值[10-12]。目前,云南珠芽魔芋种植面积已超过574 hm2,每年每公顷产 0.2～0.4 t。随着珠芽魔芋推广种植面积的不断扩大,自然环境的变化及致病菌持续积累,病害对珠芽魔芋推广及产业发展所造成的影响日渐严重。

现阶段关于珠芽魔芋病害的研究较少。Yu等报道珠芽魔芋贮藏期病害主要由茄病镰孢Fusariumsolani、尖镰孢F.oxysporum及灰霉菌Botrytiscinerea侵染而发生,人工接种发病率分别为100%、83%及95%,并针对不同病原菌开展了相应的药剂防治研究[13]。Yang等研究发现胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides侵染会引起珠芽魔芋叶斑病[14]。魏环宇等报道软腐果胶杆菌Pectobacteriumaroidearum是引起珠芽魔芋软腐病的致病菌[10]。吴旭等对不同品种珠芽魔芋细菌性软腐病抗性做了系统的比较和鉴定[15]。

珠芽魔芋叶斑病田间主要危害叶片,病斑多数沿着叶尖、叶缘或叶脉发生,发病初期在叶片上形成浅褐色小斑点,斑点中间多透明或灰色;至发病中期常形成穿孔,病斑周围亦有黄色晕圈;发病后期病斑扩大形成不规则大斑块,叶片边缘黑褐色并坏死,在病斑黑褐色部位常明显着生有黑色小颗粒,发病严重时整个叶片布满斑痕,枯死并脱落,新发及成熟叶片均可发病,传染性强。本文对引起该病害的致病菌进行了形态学鉴定和分子生物学鉴定,以期为田间防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病害症状观察和病原菌分离

于云南省西双版纳傣族自治州、德宏傣族景颇族自治州珠芽魔芋种植区采集典型病样,采用常规组织分离法分离,将分离得到的菌株转移至PDA培养基进行纯化和形态观察。

1.2 致病性测定

选用健康无病,无伤痕的魔芋叶片,用75%乙醇多次擦拭表面后再用无菌水反复冲洗,选取代表性菌株BNYB03配制浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液；针刺法于叶片创伤处滴0.5 mL孢子悬浮液;悬滴法将1 mL 孢子悬浮液直接滴于健康叶片,对照滴等量无菌水。每株接种2片健康叶片,每处理3次重复,每次重复3株,每24 h观察1次,发病后从发病组织再次分离,并观察是否和接种菌相同,接种后15 d计算发病率。

1.3 病原菌形态学观察

肉眼观察在PDA培养基上纯培养的菌落形态。挑取菌落上的分生孢子,在光学显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗的形态并测量分生孢子的大小,参照文献[16-20] 确定病原菌的种类。

1.4 病原菌的分子生物学鉴定

取纯培养的病原菌,刮取培养基表层菌丝,于液氮中快速研磨,利用真菌通用引物[21]和特异引物[22]对该病原菌的 rDNA-ITS、EF-1α和β-tubulin基因进行了 PCR 扩增 (引物见表1),PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测后,送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序,利用DNAMAN软件对测序结果进行多重比较，测序结果登录NCBI (https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast),利用 BLAST 进行同源性比对;使用 MEGA 7 构建系统发育树。

表1 病原菌的 rDNA-ITS、EF-1α和β-tubulin基因的PCR扩增引物Table 1 PCR primers for amplifying rDNA-ITS, EF-1α and β-tubulin genes of the pathogen

2 结果与分析

2.1 发病症状

该病主要危害叶片,且成熟叶和新叶均可见发病。病斑多数沿叶缘或叶脉发生,发病初期,出现圆形黄色斑点,约2～3 mm,周围多有黄色晕圈;随着病情发展,逐渐形成大块棕色病斑或融合形成不规则大斑块,并持续向两侧叶缘及叶片中央侵染,最终危害整株叶片 (图1)。若阳光灼伤叶片后,连续阴雨天气易加剧该病害蔓延。

图1 珠芽魔芋叶斑病田间典型症状Fig.1 Typical symptoms of Amorphophallus bulbifer leaf spot disease in the field

2.2 病原菌的分离及致病性测定

针刺法接种在接种后 3 d 开始发病,接种后15 d发病率为100%,叶面病斑初为圆形或椭圆形黄色小斑点,后期病斑逐渐扩大,且中央颜色逐渐变为黄褐色,病斑周围带有明显黄色晕圈 (图2a)。悬滴法接种在接种后 5 d可见圆形或椭圆形黄色斑点,后期症状与针刺法相同 (图2b),接种叶片均发病。对照叶片未见发病 (图2c)。取发病叶片再次分离可得到接种菌株。对照叶片未分离出接种菌。根据柯赫氏法则,证明接种菌株BNYB03为该叶斑病的致病菌。

图2 人工接种珠芽魔芋叶斑病病原引起的症状(接种后15 d)Fig.2 Symptoms caused by the pathogen of the leaf spot of Amorphophallus bulbifer at day 15 after inoculation

2.3 珠芽魔芋叶斑病菌的形态特征

经柯赫氏法则确定的病原菌,菌落在 PDA 培养基上呈灰青色,毛毡状 (图3a)。于主菌丝上生成淡褐色或暗褐色的分生孢子梗,大小为(19.3～37.9)μm×(1.7～3.2)μm, 有隔膜(图3b)。分生孢子黄褐色,大小为(19.7～31.9)μm×(7.4～12.5)μm,多数为倒棒形,少数为卵形或近椭圆形,具2～6个横隔膜,1～5个纵 (斜) 隔膜,隔膜处缢缩(图3c)。在 PCA 培养基上,7 d 内可以形成超过10个孢子连成的无分支孢子链 (图3d)。依据菌株的形态特征,参照文献[16-20]关于链格孢种的形态描述,初步鉴定该病原菌为细极链格孢Alternariatenuissima(Fr.) Wiltshire。

图3 珠芽魔芋叶斑病菌的形态特征Fig.3 Morphological characteristics of pathogen causing the leaf spot of Amorphophallus bulbifer

2.4 病原菌的分子鉴定及系统发育分析

针对该病原菌的rDNA-ITS、EF-1α和β-tubulin基因序列进行了PCR扩增,分别获得长度为550 bp、280 bp和542 bp的片段。将测序结果登录NCBI(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行BLAST比对,结果表明,该病原菌与A.tenuissima的相似性为99%～100%。

基于rDNA-ITS,EF-1α和β-tubulin基因构建系统发育树(图4～图6)。结果显示,BNYB03的rDNA-ITS基因与已登录的A.tenuissima(登录号:MG975633) 相似性较高;BNYB03的EF-1α基因和β-tubulin基因分别与已登录的A.tenuissima(登录号:LC136865)和A.tenuissima(登录号:JQ811941)的相似性达到100%。结合形态特征,最终鉴定细极链格孢A.tenuissima(Fr.) Wiltshire是引起珠芽魔芋叶斑病的病原菌。

图4 基于ITS序列构建的代表菌株系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS sequences of representative isolates

图5 基于EF-1α 序列构建的代表菌株系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on EF-1α sequences of representative isolates

图6 基于β-tubulin序列构建的代表菌株系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree based on β-tubulin sequences of representative isolates

3 结论与讨论

本文从西双版纳、德宏州等珠芽魔芋种植区采集叶斑病典型病样,将病原菌分离并接种于健康珠芽魔芋,发病症状与田间症状一致,接种病株亦可同样分离得到此病原菌,完成柯赫氏法则验证。对病原菌的形态学鉴定发现本研究菌株孢子的横隔数为2～6个,可形成超过10个孢子连成的无分支孢子链态,结合文献[16-20]对链格孢属菌的描述对比分析,发现本研究菌株形态特征同细极链格孢A.tenuissima极为相似,结合病原菌rDNA-ITS,EF-1α和β-tubulin基因序列分析结果,最终明确引起珠芽魔芋叶斑病的病原菌为细极链格孢A.tenuissima(Kunze) Wiltshire。

目前,国内外有较多关于链格孢属真菌侵染而引起植物叶斑病的研究报道。王彩霞等研究发现葡萄叶斑病病原菌为链格孢Alternariaalternata,葡萄链格孢A.viniferae和乔木链格孢A.arborescens,且3种病原菌单独侵染或复合侵染均能引起葡萄叶斑病[23],而刘梅等研究发现平头炭疽菌Colletotrichumtruncatum也是引起葡萄叶斑病的致病菌[24]。此外,细极链格孢A.tenuissima侵染还会引起蚕豆[25]、甜叶菊[26]等多种植物叶斑病。Yang等研究发现,胶孢炭疽菌C.gloeosporioides是引起珠芽魔芋叶斑病的病原菌[14],而细极链格孢侵染所引起的珠芽魔芋叶斑病在国内尚属首次报道。

本研究调查发现,珠芽魔芋叶斑病田间发病率一般为7%～15%,每年9月 - 11月是珠芽魔芋叶斑病发病高峰期,重症区域损失可达25%以上,表明链格孢属真菌生长和繁殖受温度、湿度的密切影响,夏季与早秋适宜的环境温度加剧了链格孢属病原菌的侵染和病害发生。因此,应在病害高发时期加强农业防治,调整和改善作物生长环境,创造不利于病原物生长发育的生态位,控制传播途径,削弱侵染活力,预防病害大规模暴发。后续还需要对珠芽魔芋叶斑病病原菌种类和优势种群做系统调查,明确该病害发生与流行规律,为珠芽魔芋叶斑病防治技术研究奠定基础。