凌 彬, 纪 颖, 白 云, 朱家君, 陈思宇,李紫溢, 段 可, 高清华

(1. 上海海洋大学食品学院, 上海 201306; 2. 上海市农业科学院林木果树研究所, 上海 201403; 3. 上海应用技术大学生态技术与工程学院, 上海 201418)

炭疽菌属ColletotrichumCorda真菌隶属于真菌门Eumycota,半知菌亚门Deuteromyeotina,腔孢纲Coelomycetes,黑盘孢目Melanconiales,黑盘孢科Melanconiaceae[1]。其种类繁多,寄主广泛,可侵染多种水果、蔬菜和粮食作物,给各类经济作物带来巨大的灾难。草莓Fragaria×ananassaDuch.叶柄、枝干、匍匐茎、花和果实等都可被炭疽菌侵染[2]。病原菌一旦侵入草莓植株,在适宜的温湿度条件下可迅速扩散,给草莓育苗和生产带来毁灭性的危害。草莓炭疽病的防控措施以农业防治、化学防治、生物防治为主[2],但是这些方法都具有一定的局限性,特别是农药的长期使用不仅给生态环境和食品安全带来极大威胁,而且会导致炭疽菌的抗药性增加[3]。因此,找到一种环境友好且行之有效的炭疽病防治措施是现今亟待解决的问题。

太阳光谱中紫外线(ultraviolet,UV)根据波长大小分为3个区间:UV-A (315～400 nm)、UV-B (280～315 nm)、UV-C (100～280 nm)[4]。在这3个波段中,只有UV-A和UV-B能够到达地球表面,而UV-C由于大气中的臭氧层可大幅度降低波长小于320 nm辐射的穿透能力则完全无法透过[5]。UV-A和UV-B主要影响生物的形态发生和向光性,UV-B和UV-C能激发次生代谢物产生;3类紫外线以UV-C辐照能量最高。UV-C对生物的影响分直接和间接两类,直接效应包括DNA伤害、蛋白多聚化、酶失活、细胞膜通透性增加等,间接效应主要有提高活性氧粒子ROS的积累,增加包括酚类在内的次生代谢物积累[6]。紫外线辐照对真菌的孢子萌发、存活、繁殖、分布、扩散、致病性和毒性都有重要影响。UV-C辐照对病原微生物的影响与剂量相关,致死剂量的辐照可以直接灭活大部分的分生孢子;亚致死剂量的辐照可降低分生孢子的萌发速度,从而降低毒力;更低且适宜剂量的紫外照射可促使病原菌产孢、有利于病原扩散[7]。病原真菌不同细胞结构对紫外线辐照的耐受力不同,一般孢子耐受性比菌丝强,且孢子的形态和代谢产物等影响其耐受力,体积大、色素积累多的真菌孢子比小的、透明的真菌孢子更耐受UV辐射[8]。此外,菌丝生长过程环境中物理、化学、营养等条件也影响所产孢子对包括紫外线在内多种胁迫的耐受性,这是因为环境因子显著影响微生物自我修复进程[9]。比如,微生物经紫外辐照后普遍存在光修复,在球孢白僵菌Beauveriabassiana对UV-C辐照响应研究中,对UV-C诱导形成的环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutane pyrimidine dimers, CPD)定量分析发现,480 J/m2剂量的UV-C辐照下形成 CPD数量为15个/10 kb,在进一步培养中,球孢白僵菌通过光修复和核酸切除修复可显著降低每10 kb形成CPD的数量[10]。

研究表明,低剂量UV-B 辐照能够促进胶孢炭疽菌C.gloeosporioides的菌丝生长和孢子萌发；当UV-B不直接作用于炭疽菌而是直接辐照到苹果上,可诱导抗氧化防御系统过氧化氢酶活性,限制炭疽病斑扩展，使苹果的抗病性增强[11]。高剂量UV-B辐照对尖孢炭疽菌C.acutatum的生长有抑制作用,并随着辐照时间的增加而加强;紫外照射结束后光照培养12 h炭疽菌分生孢子存活率比持续黑暗培养高;不同菌株对UV-B敏感性存在差异,即使完全一致的生境中分离的尖孢炭疽菌不同菌株,其孢子对UV-B辐照的耐受性也可能存在显著差异[12]。美国农业部下属阿巴拉契亚果树研究实验站利用55 W的紫外灯在30 cm上方照射，分析UV-C对两种草莓炭疽病病原孢子生长的影响,结果表明，紫外辐照后可见光下培养要完全抑制尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌生长分别需要紫外辐照60 s和90 s,而如果紫外辐照后黑暗培养4 h以上则分别仅需紫外辐照45 s和60 s就可彻底抑制两种孢子发展为菌落[13]。但这些研究都没有进一步的量化比较。此外,在我国大陆和台湾地区对草莓危害严重的是胶孢炭疽菌复合种下的3种菌:暹罗炭疽菌C.siamense、果生炭疽菌C.fructicola和胶孢炭疽菌C.gloeosporioides[14-17], 前两种优势菌种对UV-C的耐受性尚无报道。因此,UV-C如何影响我国草莓炭疽病优势病原菌生长和致病力,不同炭疽菌对UV-C的反应有何差异,值得进一步探究。

本文以果生炭疽菌、胶孢炭疽菌、暹罗炭疽菌为材料,研究了UV-C照射对其分生孢子的相对存活率、产孢能力、菌丝生长和对草莓叶片致病力的影响。本研究可为我国草莓炭疽病的非化学农药控制新途径探索、延缓炭疽菌对杀菌剂的耐药性、推进草莓绿色生态栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株、草莓材料

胶孢炭疽菌复合种Colletotrichumgloeosporioidessensulato(complex/aggregate)是我国大部分草莓产区炭疽病的主要致病菌。供试菌株分别为CGMCC3.17371(C.fructicola,分离自上海青浦草莓病样[18])、Jsh-7-1(C.gloeosporioides,分离自武汉草莓病样)、Nj-2(C.siamense,分离自南京草莓病样)[14]。供试草莓为易感炭疽病的‘黄毛草莓’Fragarianilgerrensis无菌组培苗。3种炭疽菌和草莓资源均保存于上海市农业科学院林木果树研究所草莓课题组。

1.2 试验方法

1.2.1UV-C辐射装置

将UV-C紫外灯(λ=254 nm,TUV 25W/G25 T8,Philips)放入超净工作台(SW-CJ-1F,上海宇涵生物科技有限公司)中,使灯管距离工作台面30 cm,开启紫外灯5 min后,用辐照计(UV-B型双通道,北京师范大学光电仪器厂)测量紫外灯管下30 cm处UV-C的辐照度为3.5 W/m2。当此UV-C紫外灯照射0、30、60、90 s和120 s时,各辐照时间下的辐照剂量分别为0、105、210、315 J/m2和420 J/m2;当照射4、6、8、10、12 min时,相应的辐照剂量为840、1 260、1 680、2 100、2 520 J/m2。照射过程中培养皿保持开盖,周边环境黑暗。下文将UV-C辐照30～120 s统称为低辐照剂量,4～6 min为中辐照剂量,8～12 min为高辐照剂量。

1.2.2孢子悬浮液的制备

用手术刀从生长7 d的C.fructicola、C.gloeosporioides、C.siamense的新鲜菌饼上分别割取6个菌块于30 mL马铃薯葡萄糖肉汤(PDB, Lot#9021639, 美国BD公司)培养基中,在摇床(DHZ-DA,苏州培英实验设备有限公司)上28℃、200 r/min培养7 d后用两层擦镜纸过滤到离心管中,取20 μL滤液于血球计数板上在显微镜(E200型,上海尼康仪器有限公司)下计数,最终用无菌水稀释,配制成1×106个/mL的孢子悬浮液。

1.2.3UV-C辐照对炭疽菌分生孢子存活的影响

用无菌水稀释上述炭疽菌孢子悬浮液至孢子浓度为2×103个/mL,吸取50 μL至含0.08 g/L脱氧胆酸钠(裂解细胞阻止菌丝生长)的25 mL马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上并涂布均匀,之后立即放置在距离UV-C紫外灯下30 cm处照射,照射时间分别为0、30、60、90 s和120 s。紫外辐照结束后立即放入恒温培养箱(SPX-150-GB型,上海万锐实验室设备有限公司)28℃ 黑暗下培养,每个处理3次重复,本试验独立重复2次。

培养48 h后,计数每个培养皿上的菌落形成单位(colony forming unit, cfu),其分生孢子的相对存活率按以下公式计算:

相对存活率=(Mt/Mc)×100%[8]；

其中Mt指在辐照时间t下3个重复的平均cfu值,Mc指对照培养皿上的平均cfu值。

1.2.4UV-C辐照炭疽菌孢子对菌丝生长的影响

将孢子浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液滴在PDA平板上,每个平板滴3处,各10 μL,每个处理3皿,静置5 min后在距离UV-C紫外灯下30 cm处分别照射0、2、4、6、8、10、12 min,辐照结束后立即放入恒温培养箱28℃ 黑暗下培养。72 h后采用十字交叉法测量菌落直径,本试验独立重复2次，计算菌丝生长抑制率。

抑制率=(未辐照处理菌落直径-辐照处理后菌落直径)/未辐照处理菌落直径×100%。

1.2.5UV-C辐照炭疽菌菌丝对分生孢子产量的影响

C.fructicola、C.gloeosporioides、C.siamense28℃培养3 d后，在新鲜菌落外围分别打取直径为5 mm的菌块,各取6块置于灭菌的培养皿上,立即放置在UV-C紫外灯下30 cm处照射0、2、4、6 min。照射完毕后立即转移至20 mL PDB液体培养基中,28℃、200 r/min培养3 d后用血球计数板测定分生孢子浓度,试验独立重复4次。

1.2.6UV-C辐照炭疽菌孢子和接种‘黄毛草莓’叶片

取5 mL 浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液置于直径9 cm培养皿中,在UV-C紫外灯下30 cm处分别照射0、2、6 min。收集处理过的孢子悬浮液并在其中加入0.01% (V/V)的吐温-20,混匀备用。

参考韩永超等[19]的草莓离体叶片接种方法,并略作修改。剪取‘黄毛草莓’无菌组培苗的叶片,在其叶柄伤口处裹上一层石蜡,用镊子分别将其浸没在上述经过UV-C处理的孢子悬浮液中,直到叶片上有水滴流下来为止,放入垫有湿润滤纸的培养皿中,每处理3皿,以不进行辐照处理孢子接种为对照。接种完成后用膜封口保湿,置于GXZ型智能光照培养箱(宁波江南仪器厂)中,先在黑暗下25℃培养48 h,然后置于25℃,光周期L∥D=12 h∥12 h下培养。分别在接种后第3天和第5天调查发病情况,统计病情指数(disease index, DI),试验独立重复2次。

病情严重程度根据病斑总面积占叶片总面积的比例(A)来评价，共分6个等级:0级,健康叶片,没有病斑;1级,0.1%50%[20]。病情指数计算公式如下:

1.2.7数据分析

利用Excel 2016软件进行柱状图的绘制,用OriginPro 2019软件绘制折线图和箱图,用IBM SPSS statistics(version 19)软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 UV-C辐照对炭疽菌分生孢子存活的影响

分生孢子悬浮液滴加在含有脱氧胆酸钠的PDA平板上经UV-C照射后，置于28℃黑暗培养48 h，根据处理组与对照组cfu之间的比值(相对存活率)评价UV-C辐照对孢子存活的影响。从图 1a可知，UV-C照射时间对3种炭疽菌分生孢子的相对存活率有显著影响。在UV-C照射120 s(辐照剂量420 J/m2)时，3种炭疽菌的相对存活率在4%或以下。420 J/m2已接近分生孢子的致死剂量。

图1 UV-C辐照不同时间对3种炭疽菌分生孢子相对存活率的影响Fig.1 Influences of different UV-C irradiation durations on the relative survival rate of conidia of three Colletotrichum species

除C.fructicola经UV-C照射120 s(辐照剂量420 J/m2)与照射90 s(辐照剂量315 J/m2)后孢子相对存活率差异不显著外，随着辐照时间从30 s增加到120 s(辐照剂量从105 J/m2增加到420 J/m2)，3种炭疽菌孢子的相对存活率显著降低，说明3种炭疽菌孢子的相对存活率对UV-C辐照的剂量响应存在显著差异。

3种炭疽菌中C.fructicola对UV-C辐照最为敏感。辐照后其孢子相对存活率最低，辐照30～120 s(辐照剂量105～420 J/m2)后相对存活率较对照下降了44%～98%，且显著低于C.gloeosporioides。当UV-C辐照90 s(辐照剂量315 J/m2)时，C.gloeosporioides的孢子相对存活率仍维持在15% 以上，而另外两种菌相对存活率均在10%以下，3种菌之间差异显著。继续延长辐照时间至120 s(辐照剂量420 J/m2)时，C.gloeosporioides的孢子相对存活率仍然显著高于另两种菌。可见，3种炭疽菌中C.gloeosporioides孢子对UV-C辐照的耐受性最强。

2.2 UV-C辐照对炭疽菌菌落生长的影响

不同辐照时间下，3种炭疽菌菌落直径分布如图2a所示。在中低辐照剂量(辐照时间30 s～6 min,辐照剂量105～1 260 J/m2)时，3种炭疽菌菌落直径随着辐照剂量增加，时间延长而下降，但在相同辐照剂量下，3种菌菌落直径相差不大。当辐照时间延长至8 min(辐照剂量1 680 J/m2)时，C.fructicola和C.gloeosporioides部分菌落无法生长，且菌落直径变化范围较大，而C.siamense菌落都可生长。辐照时间增至10 min(辐照剂量2 100 J/m2)时，C.siamense也出现菌落不生长的情况。在辐照8 min及以上高辐照剂量处理下，炭疽菌菌落形成受到严重抑制，菌落大小有较大差异或仅部分接种点可形成菌落。

图2 UV-C辐照不同时间对3种炭疽菌菌落生长的影响Fig.2 Influences of different UV-C irradiation durations on colony development of three Colletotrichum species

在中低辐照剂量(剂量≤1 260 J/m2，辐照时间≤6 min)下，3种炭疽菌菌落直径变化如图2b所示。随辐照剂量增加，C.gloeosporioides和C.siamense的菌落直径显著降低，而C.fructicola经UV-C辐照6 min与辐照4 min的处理菌落直径没有显著差异。C.siamense的菌落直径最小，在未辐照或辐照2～4 min时菌落直径显著低于其他2种菌；辐照时间延长至6 min，C.siamense的菌落直径显著低于C.fructicola，而C.gloeosporioides与它们差异均不显著。

2.3 UV-C辐照对炭疽菌分生孢子产量的影响

将经UV-C辐照不同时间的菌块在PDB液体培养基中振荡培养3 d后分析产孢量(图3),结果显示，未经UV-C辐照的对照中,3种炭疽菌的产孢量从大到小排列:C.siamense>C.gloeosporioides>C.fructicola。随着UV-C辐照时间的延长,3种炭疽菌产孢量均明显下降,但当UV-C照射延长至6 min(辐照剂量为1 260 J/m2)时,C.fructicola的产孢量不降反升,其余两种炭疽菌没有观察到这种现象。

图3 UV-C辐照不同时间对3种炭疽菌产孢能力的影响Fig.3 Influences of different UV-C irradiation durations on the sporulation ability of three Colletotrichum species

2.4 UV-C辐照对炭疽菌在‘黄毛草莓’叶片上致病力的影响

用浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液喷雾接种‘黄毛草莓’叶片,观察第3天和第5天的病症严重程度,叶片上病程发展如图4所示:随着UV-C辐照时间的增加,3种炭疽菌导致的病情严重度逐渐下降(表1，表2)。

图4 经UV-C辐照后3种炭疽菌对‘黄毛草莓’的致病力Fig.4 Pathogenicity of three Colletotrichum species to Fragaria nilgerrensis leaves after conidia exposed to UV-C irradiation

表1 UV-C辐照后的3种炭疽菌接种‘黄毛草莓’叶片所致的病情指数(3 dpi)1)Table 1 Disease indices of Fragaria nilgerrensis leaves after inoculation with UV-C treated conidia of three Colletotrichum species (3 dpi)

表2 UV-C辐照后的3种炭疽菌接种‘黄毛草莓’叶片所致的病情指数(5 dpi)Table 2 Disease indices of Fragaria nilgerrensis leaves after inoculation with UV-C treated conidia of three Colletotrichum species (5 dpi)

接种后5 d,未经UV-C照射的C.gloeosporioides所致病情指数最低,为59.26,与第3天不同的是,此时C.siamense所致病情指数略高于C.fructicola。UV-C照射2 min时,C.fructicola和C.gloeosporioides所致病情指数与对照相比大幅度下降,且与C.siamense存在显著差异。C.siamense经过UV-C照射2 min,其所致病情指数与对照相比下降幅度小但与第3天相比大幅度上升。继续延长UV-C辐照时间至6 min时,C.siamense所致病情指数与对照和辐照2 min相比大幅下降,C.gloesosporioides所致病情指数与辐照2 min相比下降幅度不大。

3 结论与讨论

研究表明,低剂量的UV-B辐照能够增强胶孢炭疽菌抗氧化能力[11],但低剂量UV-C辐照对炭疽菌病原影响尚无报道。本研究选择病原菌抗性最强的细胞结构—孢子进行分析,结果表明,相比无辐照的对照组,辐照剂量为105 J/m2(辐照30 s)时,C.gloeosporioides,C.siamense和C.fructicola孢子活性都显著下降,孢子相对存活率分别下降约8%，50%和30%。因此,估计100 J/m2以上的UV-C辐照剂量可以用于对3种炭疽菌的控制。UV-C 420 J/m2(辐照2 min) 对C.fructicola、C.gloeosporioides、C.siamense菌落生长抑制率分别为15%,11%,9%(图2b)。Takeda等[13]使用55 W的UV-C灯在30 cm处辐照60 s(辐照剂量未知)可彻底抑制10 μL 104个/mL(约100个孢子)的胶孢炭疽菌菌株CG162孢子形成菌落。本研究采用25 W的紫外灯在30 cm处对约100个C.gloeosporioides孢子辐照120 s(辐照剂量420 J/m2)不能完全抑制其萌发；对总量104孢子的定点培养平板辐照12 min(辐照剂量2 520 J/m2)可抑制 89% 的C.gloeosporioides孢子萌发形成菌落。28℃新鲜生长3 d的C.gloeosporioides菌丝仅需辐照2 min 几乎不能产孢,产孢量仅为无辐照的2.5%。因此,对草莓炭疽病菌来说,基因型、群体大小、辐照剂量和特定生命过程均影响其对UV-C的耐受性。

3种菌对UV-C的相对耐受性高低在不同生命过程表现不一致。菌丝产孢过程,C.gloeosporioides对UV-C辐照最敏感,C.siamense最耐受,可能与正常条件下其菌丝生长速度和产孢量差异有一定关系。在低密度孢子存活力方面,C.fructicola的孢子对辐照的耐受性最低,C.siamense耐受性居中,C.gloeosporioides表现的耐受性最高。在菌丝扩展过程,中低剂量UV-C(2～6 min，辐射剂量420～1 260 J/m2)下,3种炭疽菌孢子的菌丝扩展能力下降程度无显著差异;辐照剂量增加到1 680 J/m2(辐照时间8 min)时C.siamense表现耐受性最强;更高剂量2 520 J/m2(辐照时间12 min)时,C.fructicola表现最耐受。

值得注意的是,C.fructicola的菌丝经辐照后形成孢子、或高密度孢子经辐照后形成菌落的试验中,都发现这种菌虽然对UV-C辐照很敏感,但是对高剂量UV-C辐照表现出快速适应，由此推测,进一步提高辐照剂量也不一定能达到C.fructicola致死剂量。前人在研究140个马铃薯疫霉Phytophthorainfestans菌株对UV-C辐照的耐受性中发现,这些菌株耐受紫外辐照的可塑性(plasticity)是遗传力(heritability)的6～60倍,平均16倍[22]。C.fructicola对UV-C表现出很高的可塑性,这可能与紫外辐照降低DNA复制中细胞校对效率引起的诱变效应有关[23],但是基因突变通常会有生命力或适应性代价(fitness penalty),因此这种可塑性也离不开基因表达和/或酶活性改变[24]。在中低剂量UV-C辐照(辐照剂量420～1 260 J/m2)下,C.siamense不论产孢能力还是菌落形成能力均表现耐受性最强,推测这种菌在阻止或降低细胞内组分受到辐照伤害以及系统修复伤害能力相关的保护机制可能较强大[10]。

本研究发现,无UV-C处理下,C.gloeosporioides致病力最低,接种后3 d以C.fructicola致病力最强,接种后5 d以C.siamense致病力最强。前人研究发现 ‘阿尔比’草莓叶片接种经UV-C辐照3 min 的C.gloeosporioides3 d后,其病情指数比未经辐照的对照菌株处理下降50%以上[16]。本研究中C.gloeosporioides经过2 min或6 min辐照后,致病力与未经UV-C辐照的菌相比有所下降,但下降幅度不大,可能与所用菌株致病力较低有关。UV-C辐照2 min (辐照剂量420 J/m2)处理,C.fructicola和C.siamense对‘黄毛草莓’的致病力在接种后3 d显著下降,其中C.fructicola致病力下降程度最大;但在接种后5 d,C.siamense处理的病情指数仅有小幅下降,表明该菌在此剂量下虽然前期致病力有下降但后期致病力未受到明显抑制;中低辐照剂量处理,C.siamense对‘黄毛草莓’的致病力最强。对比分析UV-C对3种炭疽菌的致病力和生活力的影响,可发现早期致病力最强的C.fructicola对低剂量UV-C很敏感但对高剂量UV-C辐照表现出超出其他菌种的可塑性,而后期致病力更强的C.siamense对不同剂量的UV-C耐受性都比较强;孢子存活力方面,致病力最弱的C.gloeosporioides对UV-C的耐受性较强。鉴于炭疽菌对紫外线UV-C耐受的复杂性,可推论不同草莓炭疽病致病菌的致病力与其对UV-C的耐受性没有明显相关性。这一发现与马铃薯疫霉群体对UV-C的耐受性的研究结果类似,说明对UV-C耐受性强的基因型不存在或仅有低水平的适应性代价[22,25]。UV-C对炭疽菌和草莓这一植物病理系统的影响是复杂的。要将UV-C应用在控制炭疽病害上,需要立足草莓与炭疽菌互作,找到对草莓无伤害又能显著降低几种优势炭疽菌种生活力与致病力的辐照剂量。因此,今后有必要研究UV-C辐照对草莓植株的安全性,结合分析草莓形态发生、代谢过程和抗性反应等对UV-C不同剂量的响应,筛选对草莓无伤害又有抑制炭疽病菌效应的剂量,为探索草莓炭疽病物理控制提供更多有价值的参考。