魏 琪, 朱旭晖, 何佳春, 万品俊, 傅 强

(中国水稻研究所, 水稻生物学国家重点实验室, 杭州 310006)

水稻是世界上最重要的粮食作物之一,它养活了世界近一半的人口[1]。在我国有65%以上的人口以大米为主食,2020年我国稻谷种植面积为3 007.6 万hm2,占全年粮食播种面积的25.8%[2],因此,水稻对保障我国粮食安全至关重要。然而,水稻整个生长过程中常会遭受到多种害虫侵扰,尤以稻飞虱(褐飞虱Nilaparvatalugens和白背飞虱Sogatellafurcifera)、二化螟Chilosuppressalis、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocismedinalis为主,这4种害虫已被农业农村部列入《一类农作物病虫害名录》[3]。现阶段,化学农药仍是国内防治农作物病虫害的最主要手段,其过量使用带来了农药残留超标、环境污染、害虫抗药性与再猖獗等一系列问题[4]。近些年来,受害虫发生基数、作物布局、种植制度和气候条件等因素影响,水稻“两迁”害虫(稻飞虱和稻纵卷叶螟)和二化螟偏重发生[5-7],抗药性问题也日趋严峻[8-11]。2020年全国范围内的抗药性监测结果表明,多个地理种群的褐飞虱对吡虫啉、噻虫嗪、噻嗪酮、吡蚜酮、呋虫胺,白背飞虱对噻嗪酮,二化螟对氯虫苯甲酰胺、毒死蜱和阿维菌素均已达到高水平抗性[12-13],这对各稻区的安全生产构成严重威胁。因此,如何科学用药、延缓害虫抗药性发展已成为我国植物保护科研工作的核心任务之一。

微生物农药是一类以细菌、真菌、病毒和原生动物或基因修饰的微生物等活体为有效成分的农药[14]。与化学农药相比,微生物农药不仅无公害、无残留,安全环保,而且不易产生抗药性、环境兼容性好[15],也更加符合当今我国对农业绿色发展的需求。目前,在水稻上登记用于防治稻纵卷叶螟、二化螟和稻飞虱的微生物杀虫剂主要包括细菌类(苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis和短稳杆菌Empedobacterbrevis)、真菌类(球孢白僵菌Beauveriabassiana、金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae和耳霉菌Conidiobolusthromboides)和昆虫病毒类(甘蓝夜蛾核型多角体病毒Mamestrabrassicaemultiple nuclear polyhedrosis virus, MbMNPV)。作为开发最早、最成功的微生物杀虫剂,苏云金芽胞杆菌主要利用自身代谢物内毒素伴孢晶体和外毒素杀死害虫,特别是鳞翅目害虫[16-17]。在我国,苏云金芽胞杆菌登记产品有200个左右,占生物杀虫剂的95%以上,在农业、林业及卫生害虫防治等领域得到广泛应用[18]。短稳杆菌GXW15-4是由我国创制的一款新型微生物杀虫剂,它分离自罹病死亡的斜纹夜蛾Spodopteralitura虫体,后经驯化、筛选、提纯而得。该菌种具有胃毒作用,其孢子在生长发育过程中产生一种蛋白质毒素,会在害虫肠道内释放出毒素导致其死亡[19]。真菌类杀虫剂主要以真菌分生孢子附着于昆虫表皮后吸水、萌发而长出芽管或形成附着胞,侵入昆虫体内,造成病理变化和物理损害,最后导致昆虫死亡,白僵菌和绿僵菌为虫生真菌的主要属种[20]。核型多角体病毒nuclear polyhedrosis virus(NPV)是昆虫病毒中发现最早、研究得较为详细的一类杆状病毒,它可经口或伤口进入虫体,游离出的杆状病毒粒子能穿过中肠上皮细胞后进入体腔,并在体腔细胞核内进行大量增殖,之后再侵入健康细胞,引起宿主生理机能紊乱、组织破坏,最后导致昆虫死亡[21]。目前已发现的600 多种杆状病毒中仅有个别NPV的寄主范围是广谱的,其中以甘蓝夜蛾核型多角体病毒的应用最多[22],尤其是针对夜蛾科和螟蛾科害虫具有较强的杀虫活性。

本试验从水稻病虫害绿色防控技术及应用角度出发,以二化螟、稻纵卷叶螟和褐飞虱为研究对象,针对5种广泛使用的微生物杀虫剂(苏云金芽胞杆菌、短稳杆菌、金龟子绿僵菌CQMa421、球孢白僵菌和甘蓝夜蛾核型多角体病毒)进行了室内毒力比较及其致死表型观察,以期为害虫抗药性治理和田间科学用药以及微生物杀虫剂的研发升级提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试杀虫剂

本研究供试的5种微生物农药相关信息如表1所示,所有药剂登记的施药方式均为喷雾。对于无靶标害虫田间推荐剂量登记的微生物农药,本试验从室内试验操作安全和田间农药减量使用的角度考虑,将统一参考稻纵卷叶螟的田间推荐中剂量进行。

表1 供试微生物杀虫剂信息汇总表Table 1 Details of microbial insecticides used in this study

1.2 供试昆虫

本研究中二化螟、稻纵卷叶螟和褐飞虱分别于2020年4月、7月和8月采自浙江省杭州市富阳区中国水稻研究所科研基地试验田,其中二化螟采集虫态为越冬代老熟幼虫,之后于室内化蛹、羽化,成虫饲以10%蜂蜜水,让其在‘TN1’水稻苗上产卵,待卵孵化后,用半人工饲料法[23]进行室内饲养;稻纵卷叶螟的成虫用捕虫网采集,之后转移至去底透明塑料瓶(1.5 L),底部用纱布封口,饲以10%蜂蜜水,让其产卵于瓶内壁,待其孵化后接于无虫、分蘖期感虫品种‘TN1’水稻苗上;褐飞虱的采集虫态为高龄若虫和成虫,饲以分蘖期‘TN1’水稻。本研究药效测定试验均使用室内饲养各昆虫种群的第一代幼虫或若虫,饲养和试验均在(27±1)℃、相对湿度为(70±5)%、L∥D=16 h ∥8 h的人工气候室内进行。

1.3 农药室内毒力测定和致死表型观察

本试验中供试微生物杀虫剂按每公顷用水量450 L和各产品的田间推荐中剂量(下文统一用推荐剂量表示)进行配制,供试水稻品种为‘TN1’。微生物农药对二化螟的毒力测定采用稻苗浸渍法[24],药液浓度设置为推荐剂量、1/2和1/5推荐剂量和清水对照,每个浓度体积为500 mL。将稻种催芽后播种于直径16 cm花盆中,每盆60株,待三叶一心时除去枯黄叶鞘待用(期间未接触农药)。按需配制各浓度药液后,将稻苗倒置于药液中浸渍10 s后取出,晾干至无明水,将稻茎齐根剪下,去除上部叶片,留下约5 cm 的茎秆,放入直径6 cm 的培养皿中(每皿底部垫入3层滤纸,加入2 mL无菌水保湿),每皿10个茎秆;用毛笔挑入10 头二化螟3 龄中期幼虫,每个处理重复3次,用黑棉布覆盖后盖上培养皿,以防二化螟幼虫逃逸。将处理后的二化螟幼虫放置于人工气候室,之后每天检查和记录二化螟幼虫的死亡情况,以用毛笔轻触虫体,虫体不能协调运动者判定为死亡;同时观察和记录死虫表型特征,并用Canon EOS 50D数码相机进行拍照。

微生物农药对稻纵卷叶螟的毒力测定采用叶片浸渍法,浓度设置同上。在分蘖期水稻(温室种植,期间未接触任何农药)上剪取收集足够数量的水稻叶片(约1 cm宽、5 cm长),置于50 mL灭菌离心管中,然后将各浓度药液倒入管内,拧紧盖子,缓慢上下颠倒10次,将叶片取出晾干,放入直径6 cm 的培养皿中(每皿底部垫入3层滤纸,加入2 mL 无菌水保湿),每皿8片;用毛笔挑入10 头稻纵卷叶螟2龄中期幼虫,用黑棉布覆盖后再盖上培养皿,以防幼虫逃逸。每个处理重复3次,饲养条件、死虫记录和表型观察等同二化螟。

微生物农药对褐飞虱的毒力测定采用稻茎浸渍法[25]。浓度设置为推荐剂量，2倍推荐剂量及1/2、1/5推荐剂量和清水对照,每个浓度体积为500 mL。将健壮一致的分蘖后期稻株连根拔出洗净根部,剪成约10 cm长的带根稻茎,3株为一组,于荫凉处晾至表面无水痕;将晾好的稻茎分别在不同浓度的药剂中浸30 s,每个浓度3个重复,取出后晾干,用海绵包裹水稻根部固定于550 mL塑料瓶孔,并放置于加有清水的塑料杯中,以备接虫。取生长一致的3龄中期若虫放入培养瓶,每瓶15头,用纱布封口。饲养条件和死虫记录同二化螟。表型观察采用Canon EOS 50D数码相机和LEICA M205A体视显微镜进行拍照。

1.4 数据分析

采用DPS 14.50和GraphPad Prism 8.2.1进行数据分析并作图。采用Dunnett法检验同种药剂在相同处理时间下对照组与各浓度处理组害虫存活率的差异显著性;同种药剂处理不同害虫和不同药剂处理同种害虫的校正死亡率之间用t测验或Duncan氏新复极差法检验差异显著性,所有的百分数数据方差分析前经反正弦平方根转换。

2 结果与分析

2.1 苏云金芽胞杆菌对二化螟和稻纵卷叶螟的毒力及致死表型

用苏云金芽胞杆菌推荐剂量处理的稻茎饲喂二化螟幼虫,其存活率在第5天时才开始显著低于空白对照,第6天达到极显著差异水平,其他两个浓度则差异不显著(图1A);在致死表型方面,二化螟在第2天时有个别幼虫出现中毒症状,体色变深、行动稍缓,甚至死亡(图1A1和1A2),第4天时虫体出现发黑、流脓,最后萎缩、变干(图1A3)。对于稻纵卷叶螟,用苏云金芽胞杆菌3个浓度处理的稻叶饲喂第2天其存活率就开始显著低于空白对照,且存活率与药剂浓度负相关,1/2推荐剂量和推荐剂量处理组在第4天的存活率为0(图1B);在致死表型方面,稻纵卷叶螟幼虫于第2天开始出现死亡,部分虫体发黑、行动变缓(图1B1),第3天时虫体腐烂、流脓(图1B2),第4天和第5天时虫体萎缩、变干(图1B3和1B4)。

图1 苏云金芽胞杆菌对二化螟(A和A1～A3)和稻纵卷叶螟(B和B1～B4)的毒力及致死表型Fig.1 Toxicity and lethal phenotypes of Bacillus thuringiensis against Chilo suppressalis (A and A1-A3) and Cnaphalocrocis medinalis (B and B1-B4)

2.2 短稳杆菌对二化螟和稻纵卷叶螟的毒力及致死表型

短稳杆菌推荐剂量处理组中二化螟幼虫在第5天时其存活率显著低于空白对照组,在第6天出现极显著差异(图2A),1/2和1/5推荐剂量处理组在第6天时与对照组相比分别有极显著和显著差异;在致死表型方面,推荐剂量处理在第4、5天时出现死亡,死虫体色变深,身体变软,第6天时虫尸变黑、流脓(图2A1～2A3)。对于稻纵卷叶螟，推荐剂量处理下的存活率在第2天时就显著低于空白对照组,第4天以后为极显著差异;1/2和1/5推荐剂量处理的存活率分别在第3天和第4天时显著低于对照,均在第6天时达到极显著差异(图2B);在致死表型方面,推荐剂量处理下第2天时就出现死虫,虫体发黑、第3天时身体流脓,第4、5天时虫尸变干(图2B1～2B4)。

图2 短稳杆菌对二化螟(A和A1～A3)和稻纵卷叶螟(B和B1～B4)的毒力及致死表型Fig.2 Toxicity and lethal phenotypes of Empedobacter brevis against Chilo suppressalis (A and A1-A3) and Cnaphalocrocis medinalis (B and B1-B4)

2.3 球孢白僵菌对二化螟、稻纵卷叶螟和褐飞虱的毒力及致死表型

球孢白僵菌推荐剂量处理组中二化螟幼虫在第5天时才开始出现死亡,且推荐剂量、1/2和1/5推荐剂量处理的二化螟幼虫存活率均在第6天时极显著低于空白对照组(图3A);在致死表型方面,第5天时开始陆续显症,虫体发软变白,第6天时白色菌落覆盖全身(图3A1～3A2)。对稻纵卷叶螟,推荐剂量处理的存活率从第2天开始就极显著低于空白对照组，1/2推荐剂量处理组从第3天开始与对照组有极显著差异(图3B);在致死表型方面,药剂处理后第2～3天时出现体色变黑、卷曲、死亡,第4～5天时虫尸发黑、萎缩、变干(图3B1～3B4)。对于褐飞虱,推荐剂量及2倍推荐剂量处理的存活率从第4天开始极显著低于空白对照组,且两浓度之间差异不明显,1/2和1/5推荐剂量处理与对照组存活率的极显著差异出现在第5天之后(图3C);在致死表型方面,褐飞虱3龄若虫于第3天开始显症成为僵虫,体表长出明显菌体,之后白色菌体进一步生长至完全包被死虫(图3C1～3C3)。

图3 球孢白僵菌对二化螟(A和A1～A2)、稻纵卷叶螟(B和B1～B4)和褐飞虱(C和C1～C3)的毒力及致死表型Fig.3 Toxicity and lethal phenotypes of Beauveria bassiana against Chilo suppressalis (A and A1-A2), Cnaphalocrocis medinalis (B and B1-B4) and Nilaparvata lugens (C and C1-C3)

2.4 金龟子绿僵菌CQMa421对二化螟、稻纵卷叶螟和褐飞虱的毒力及致死表型

金龟子绿僵菌CQMa421推荐剂量处理组中二化螟幼虫在第4天时开始出现死亡,存活率显著低于空白对照组,并于第5天和第6天出现极显著差异(图4A),1/2推荐剂量处理组第6天时与对照组有显著差异;在致死表型方面,处理第4天时体色变深、虫体变软,第5天时死虫变僵硬,初现白色菌落,第6天时菌落变为黄绿色或绿色,覆盖死虫全身(图4A1～4A3)。对于稻纵卷叶螟,推荐剂量处理下的存活率在第2天时就极显著低于空白对照组,1/2和1/5推荐剂量分别在第4天和第5天时与空白对照组有极显著差异(图4B);在致死表型方面,稻纵卷叶螟显症早于二化螟,第3天时虫体初现白色菌落,第5天时菌落变为黄绿色或白色,覆盖全身(图4B1～4B4)。对于褐飞虱,推荐剂量和2倍推荐剂量处理下的存活率在第2天时就极显著低于空白对照组,而1/2和1/5推荐剂量与对照组的极显著差异出现在第3天(图4C)。在致死表型方面,第3天时肉眼可见黄色菌丝,此后死虫逐步全身包裹黄绿色至绿色的菌丝和分生孢子(图4C1～4C3)。

图4 金龟子绿僵菌CQMa421对二化螟(A和A1～A3)、稻纵卷叶螟(B和B1-B4)和褐飞虱(C和C1～C3)的毒力及致死表型Fig.4 Toxicity and lethal phenotypes of Metarhizium anisopliae strain CQMa421 against Chilo suppressalis (A and A1-A3), Cnaphalocrocis medinalis (B and B1-B4) and Nilaparvata lugens (C and C1-C3)

2.5 甘蓝夜蛾MNPV对二化螟和稻纵卷叶螟的毒力及致死表型

甘蓝夜蛾MNPV推荐剂量和1/2推荐剂量处理组中二化螟幼虫在第4天时开始出现死亡,身体萎缩、变软、发黑(图5A1);第6天时的存活率与空白对照有极显著差异(图5A)。相比之下,稻纵卷叶螟幼虫对甘蓝夜蛾MNPV的3个处理浓度更为敏感,从第2天开始存活率就极显著低于空白对照,且3个药剂浓度间无差异(图5B);在致死表型方面,稻纵卷叶螟幼虫显症相对较早,第2天开始死亡,体色变褐色,之后虫体进一步肿胀、腐烂、变黑、变干(图5B1～5B4)。

图5 甘蓝夜蛾MNPV对二化螟(A和A1～A2)和稻纵卷叶螟(B和B1～B4)的毒力及致死表型Fig.5 Toxicity and lethal phenotypes of Mamestra brassicae MNPV against Chilo suppressalis (A and A1-A2) and Cnaphalocrocis medinalis (B and B1-B4)

2.6 5种微生物杀虫剂对3种水稻害虫的毒力比较

分析上述试验结果可知，相较于其他两种水稻害虫，稻纵卷叶螟幼虫对5种微生物杀虫剂最为敏感，其存活率均在药剂处理后第2天时受到显著影响，且第5天的平均校正死亡率(92.9%)也显著高于二化螟(14.3%)和褐飞虱(51.3%)对应处理(表2)；二化螟对不同微生物杀虫剂的敏感性略有差别，其中金龟子绿僵菌CQMa421速效性最好，而其他4种药剂则在处理后第5～第6天时才会显著影响其存活率；对于褐飞虱而言，金龟子绿僵菌CQMa421的速效性和毒力均优于球孢白僵菌。

表2 5种微生物杀虫剂对3种水稻害虫的毒力比较1)Table 2 Toxicity comparison of five microbial insecticides against three major rice pests

3 结论与讨论

进入21世纪以来,我国水稻病虫防治从“预防为主、综合防治”时期向“绿色防控、生态治理”时期转变,这也是现阶段我国农业绿色发展的要求[26]。随着人们生活水平的不断提高,食品质量安全、环境安全和环保理念越来越受到重视,而微生物产品及其相关技术在农业领域的应用将有助于减少常规化学农药和肥料对环境及农产品的污染,有效实现维护农业生态系统的可持续发展目标[27]。

近些年来,应用微生物农药已逐渐成为水稻病虫害绿色防控技术的重要手段之一,具有我国自主知识产权的一系列创新型微生物杀虫剂产品得到了推广应用,并取得良好效果[28]。杨兰等[29]对4种微生物杀虫剂(400亿孢子/g的球孢白僵菌可湿性粉剂、32 000 IU/mg的苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂、30亿PIB/mL的甘蓝夜蛾MNPV悬浮剂和80亿孢子/mL金龟子绿僵菌 CQMa421可分散油悬浮剂)防治水稻害虫的田间药效进行了对比。结果表明,4种杀虫剂对二化螟的防效均不理想,在药后3、7 d和14 d枯鞘株率的相对防效之间均无显著差异,分别为16.8%～27.1%,39.4%～55.6%和36.1%～53.9%,其中金龟子绿僵菌相对较好,这与本研究试验结论基本一致。对稻纵卷叶螟,甘蓝夜蛾MNPV和金龟子绿僵菌在药后3、7 d和14 d的虫口校正防效均显著高于另外两种杀虫剂,其中甘蓝夜蛾MNPV悬浮剂效果最好,而球孢白僵菌效果最差,其药后7 d和14 d的校正防效仅分别为28.7%和26.7%,这与本研究室内毒力试验中球孢白僵菌5 d的校正防效为85.7%存在较大差别,这可能由于两个试验中供试的球孢白僵菌菌株有所不同,或因受到环境因素的影响导致药效不佳。对稻飞虱,金龟子绿僵菌和球孢白僵菌在药后7 d和14 d的校正防效(分别为50.6%～59.2%和68.9%～74.2%)均显著好于苏云金芽胞杆菌和甘蓝夜蛾MNPV的防效(分别为3.3%～27.1%和6.8%～33.4%),这与本研究中金龟子绿僵菌在第6天的校正死亡率(76.9%)优于球孢白僵菌(53.9%)的结论是一致的。另外,孙剑华等在黑龙江、四川等地进行了短稳杆菌对二化螟防效的田间试验,结果表明,100亿孢子/mL短稳杆菌悬浮剂的防治效果要显著高于16 000 IU/mg苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂,前者1 500 mL/hm2用量在药后30 d防效仍可达到82.3%～85.9%[30];高小文等[31]在福建、浙江、广东、江苏等地进行的田间药效试验结果表明,100亿孢子/mL短稳杆菌悬浮剂以820.3、937.4、1 093.8 mL/hm2等用量施用时对稻纵卷叶螟的防效均优于对照药剂苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂,该结论有别于本试验结果的原因可能是供试药剂的用量区别(本研究中的药剂用量相当于692.3 mL/hm2,低于上述田间试验用量),也可能与微生物杀虫剂易受环境条件(光照、温度、湿度等)影响有关[32],从而导致其与室内测定结果不同。

此外,从微生物农药对水稻害虫致死进程等相关描述比较可以看出,5种微生物杀虫剂的推荐剂量处理均对稻纵卷叶螟幼虫表现出较好的速效性,即药后第2天就能表现出中毒症状,校正死亡率为46.7%～86.7%,其优良药效也与供试的5种微生物杀虫剂均以稻纵卷叶螟为防治对象的农药登记信息是一致的。相比之下,二化螟对这些微生物杀虫剂的敏感性较弱,中毒显症进程缓慢,在药后第6天时的校正死亡率也仅为35%～55%,即便是其作为苏云金芽胞杆菌和金龟子绿僵菌CQMa421的登记防治对象,药效不佳可能是由于二化螟为钻蛀性害虫,即幼虫钻入稻茎为害,从而导致药剂不易直接接触到虫体所致。本试验中金龟子绿僵菌CQMa421是唯一的一个登记用于3种水稻害虫防治的微生物杀虫剂,且均表现出了最高毒力效果。2018年至2020年,金龟子绿僵菌 CQMa421 可分散油悬浮剂被全国农业技术推广服务中心列为水稻重大害虫防治推荐产品,在全国14个省(市)的推广应用面积约 13.3万hm2,其中稻田无化药防控技术应用面积约为1.47万hm2,可减少化学杀虫剂用量 17.6～26.4 t[33],均取得了良好的防治效果[34-36]。彭国雄等对金龟子绿僵菌CQMa421防控水稻害虫的应用技术进行了详述[33],即需要提前防治低龄幼虫(1～2 龄),尽量避免在老熟期(4～5 龄)施用,同时还应注意与化学农药进行的复配混用和助剂添加[37-38],以进一步提高微生物杀虫剂的速效性和持效性,真正实现化学农药的减量控害目标。

随着绿色农业发展战略的推进与实施,生物农药研发已成为我国生物产业、农业科研与应用的热点,并被列为国家中长期科技发展规划的重大研究领域与方向[34]。如今,微生物杀虫剂已成为我国水稻害虫综合防治技术的重要手段之一,然而这类农药在大田应用中也显现出某些局限性,如速效性较差、防治对象单一、持效期较短、对高龄幼虫不敏感、药效易受外界因素的影响。针对这些问题,今后应重点开展高毒力菌株筛选、增效助剂添加、新剂型研发、不同类型农药混配施用等方面的研究,以最大限度发挥其应用潜力。