李青杰, 方文生, 张大琪, 颜冬冬, 李 园, 王秋霞, 曹坳程

(中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)

高附加值作物的连年种植,导致大量的病原菌和虫卵在土壤中积累,严重破坏了土壤微生态环境,引发土传病害。土传病害可使作物减产60%以上甚至绝收,给农民带来巨大的经济损失[1]。目前,在作物种植前进行土壤熏蒸是控制土传病虫害最有效且稳定的方法[2]。溴甲烷对土壤病原菌、害虫以及杂草等具有良好的防治效果,可显著提高作物产量,但溴甲烷破坏臭氧层,已于2015年禁止在农业熏蒸上使用[3]。随着溴甲烷的淘汰,寻找溴甲烷的有效替代品成为研究的热点。棉隆可有效防治土传病虫害,且对臭氧层无破坏作用,被认为是溴甲烷的最佳替代品之一[4]。

棉隆是一种广谱性土壤熏蒸剂,它在土壤中水解形成异硫氰酸甲酯，可用以防治病原菌、线虫和杂草,已广泛应用于苗场、温室和果园等的设施农业中[5]。然而棉隆在杀灭病原物的同时,也破坏了土壤的微生态系统,土壤微生态受到扰动形成一种“近真空”的状态,一旦恢复作物的种植,病原菌可能会再次侵染,导致病害持续发展[6]。研究表明,向熏蒸后的土壤中添加改良剂或有机肥可以改善土壤熏蒸带来的不利影响,增加有益微生物的数量,达到持续防控病虫害的目的,从而促进作物生长[7]。

近年来,生物炭和沸石作为土壤改良剂的相关研究备受关注。生物炭来源广泛,比表面积大,可以提高土壤酶活性,改善土壤微生态环境[8]。生物炭还可以提高作物产量,改善作物品质[9]。Fang等[10]的研究表明,生物炭可以减轻氯化苦熏蒸对有益微生物和土壤微生态的负面影响,改善土壤氮代谢,促进土壤健康。沸石具有良好的离子吸附和交换能力,可以促进作物对养分的吸收,对土壤微生物和酶活性具有积极的影响[11]。在土壤中施用沸石可以提高土壤有机质,改善土壤的微结构,提高土壤的保水保肥性[12]。因此,研究棉隆熏蒸后添加生物炭和沸石对土壤微生态和病原菌的影响至关重要,可为其用于田间防治土传病害提供参考。

目前,对于熏蒸后土壤微生态恢复的研究主要集中在土壤熏蒸和微生物菌肥配施方面,关于生物炭和沸石对于棉隆熏蒸后土壤微生态的研究尚未见公开报道。为了阐明棉隆熏蒸后添加生物炭和沸石对土壤微生态和土传病原菌的影响,为其在田间的进一步推广应用提供参考,本试验测定了棉隆熏蒸后添加常用剂量的生物炭和沸石对土壤理化性质、土壤酶活性、土壤微生物数量以及土壤病原菌的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤:河北省保定市满城区连作草莓20年以上的0～20 cm深度的保护地土壤(38°59′N, 115°16′ E),土壤质地为粉质壤土,其基本理化性质为有机质16.86 g/kg、铵态氮0.53 mg/kg、硝态氮43.30 mg/kg、速效钾864.17 mg/kg、有效磷56.14 mg/kg、pH为7.38、电导率为248 μS/cm,含水量16.84%。

供试药剂:98%棉隆颗粒剂,江苏省南通施壮化工有限公司。

供试土壤改良剂:生物炭是紫茎泽兰秸秆在500℃下煅烧而成,来源于中国农业科学院植物保护研究所;沸石来源于河南省巩义市恒鑫矿产建材实业有限公司。

1.2 试验设计

称取300 g供试土壤放入500 mL宽颈广口瓶内,按照43 mg/kg的剂量将棉隆添加到土壤中并混合均匀,设置一组不做任何药剂处理的对照。加药后立即使用凡士林和保鲜膜密封瓶口,将其放置在25℃培养箱中培养10 d,熏蒸结束后敞气一周。试验共设4个处理:1)CK:不做任何药剂和添加处理;2)DZ:仅棉隆熏蒸处理,敞气结束后不做任何添加处理;3)B:棉隆熏蒸敞气结束后向广口瓶内添加3%的生物炭并混合均匀;4)Z:棉隆熏蒸敞气结束后向广口瓶内添加3%的沸石并混合均匀。每个处理3个重复,每个重复均使用300 g土壤。将上述广口瓶放在28℃培养箱中培养60 d。分别于培养的第10、30、60天取样进行土壤理化性质、酶活性、微生物数量和病原菌的测定(每次取样前都要混合均匀再取样)。

1.3 测定项目及方法

理化性质指标:土壤理化性质参照《土壤农化分析》[13]进行测定。

土壤酶活性测定:使用土壤过氧化氢酶(S-CAT)和土壤蔗糖酶(S-SC)活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)测定土壤过氧化氢酶和蔗糖酶活性,分别在240 nm和540 nm处测定样品的吸光度。

土壤微生物数量的测定:土壤微生物数量采用平板稀释法测定[14]。细菌采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,琼脂15～20 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.4～7.6),在28℃恒温培养箱中黑暗环境下培养,2 d后统计菌落数。真菌采用马丁氏培养基(KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,琼脂15～20 g,蒸馏水1 000 mL,此培养液1 L加1%孟加拉红水溶液3.3 mL),在28℃恒温培养箱中黑暗环境下培养,3 d后计菌落数。临用时以无菌操作在100 mL培养基中加入1%的链霉素0.3 mL使其终浓度为30 μg/mL。

土壤病原菌的测定:称取5 g土壤样品加入到冷却至室温的95 mL 0.7‰的灭菌琼脂水中,振荡混匀制成土壤悬浮液。在无菌操作台上,分别按照Komada[15]和Masago等[16]的方法将1 mL土壤悬浮液与培养基混合均匀并倒入培养皿内,在黑暗环境下(28℃)培养2～3 d 后记录镰刀菌Fusariumspp.和疫霉Phytophthoraspp.的菌落数。

1.4 数据处理与分析

病原菌抑制率=(对照处理的菌落数-药剂处理的菌落数)/对照处理的菌落数×100%。

采用Microsoft Excel 2010进行数据统计,采用SPSS 20.0软件单因素方差分析(ANOVA)和Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同处理对土壤理化性质的影响

2.1.1不同处理对土壤氮素的影响

从表1可以看出，培养10 d，与对照相比，仅棉隆熏蒸处理的土壤铵态氮含量显著增加了57.14%，棉隆熏蒸后用生物炭处理的铵态氮含量显著降低了73.81%。培养30 d，棉隆熏蒸后用生物炭处理的铵态氮含量比对照显著降低了28.77%。培养60 d，各处理组的铵态氮含量无显著差异。在整个培养期内，与对照相比，各处理的土壤硝态氮含量均显著增加，且棉隆熏蒸后用沸石处理的硝态氮含量最高。培养60 d，与对照相比，仅棉隆熏蒸、棉隆熏蒸后用生物炭处理和棉隆熏蒸后用沸石处理的硝态氮含量分别显著增加了153.81%、144.77%和169.78%。仅棉隆熏蒸和棉隆熏蒸后用生物炭处理的硝态氮含量在整个培养期内均无显著差异，但均显著高于对照。

表1 棉隆熏蒸联合生物炭和沸石处理对土壤氮素的影响1)Table 1 Effects of dazomet fumigation combined with biochar and zeolite on soil nitrogen

2.1.2不同处理对有效磷、速效钾、有机质、pH和电导率的影响

从表2可以看出，熏蒸后培养10 d，仅棉隆熏蒸、熏蒸后用生物炭处理和熏蒸后用沸石处理的土壤有效磷含量分别比对照显著降低38.06%、52.76%和56.13%。培养30～60 d，棉隆熏蒸后用生物炭处理的土壤有效磷含量显著高于对照和其他处理，其他处理间无显著差异。在整个培养期内，棉隆熏蒸后用生物炭、沸石处理的土壤中速效钾含量显著高于对照和仅棉隆熏蒸处理。棉隆熏蒸后用生物炭处理的土壤速效钾含量在整个培养期内比熏蒸后用沸石处理高87.83%～102.07%。棉隆熏蒸后用生物炭处理的土壤有机质含量在整个培养期内显著高于对照和其他处理。棉隆熏蒸后用沸石处理的土壤有机质含量在培养30 d时比仅棉隆熏蒸处理低12.04%，培养60 d时高44.47%。

表2 棉隆熏蒸联合生物炭和沸石处理对有效磷、速效钾、有机质、pH和电导率的影响Table 2 Effects of dazomet fumigation combined with biochar and zeolite on available P, available K, organic matter, pH and electrical conductivity

在熏蒸后10～30 d的培养期内，棉隆熏蒸后用生物炭处理的pH和对照无显著差异，但显著高于仅棉隆熏蒸处理和熏蒸后用沸石处理，培养60 d，与对照相比，仅棉隆熏蒸、棉隆熏蒸后用生物炭处理和熏蒸后用沸石处理的pH分别显著降低了4.89%、2.38%和5.01%。在整个培养期内，各处理的电导率均显著高于对照，其中棉隆熏蒸后用生物炭处理的电导率最高，在培养期结束时达到987 μS/cm。

2.2 不同处理对土壤酶活性的影响

2.2.1不同处理对土壤过氧化氢酶活性的影响

从图1可以看出，在熏蒸后10～30 d的培养期内，与对照相比，各处理土壤的过氧化氢酶活性均显著增加。培养10 d，与对照相比，仅棉隆熏蒸、熏蒸后用生物炭处理和熏蒸后用沸石处理的土壤过氧化氢酶活性分别显著增加了16.42%、9.77%和6.28%，但熏蒸后生物炭和沸石处理的过氧化氢酶活性显著低于仅棉隆熏蒸处理。培养30 d，棉隆熏蒸后用生物炭处理的土壤过氧化氢酶活性略高于仅棉隆熏蒸处理，二者无显著差异，但显著高于熏蒸后用沸石处理。培养60 d，棉隆熏蒸后用生物炭处理的土壤过氧化氢酶活性最高，显著高于对照和其他处理。对照、仅棉隆处理和熏蒸后用沸石处理的过氧化氢酶活性无显著差异，与棉隆熏蒸后用生物炭处理相比，分别降低了5.37%、4.87%和7.08%。

图1 棉隆熏蒸联合生物炭和沸石处理对土壤过氧化氢酶活性的影响Fig.1 Effects of dazomet fumigation combined with biochar and zeolite on soil catalase activity

2.2.2不同处理对土壤蔗糖酶活性的影响

从图2可以看出，在熏蒸后10～30 d的培养期内，与对照相比，各处理土壤的蔗糖酶活性均显著增加。培养10 d，与对照相比，仅棉隆熏蒸、熏蒸后用生物炭处理和熏蒸后用沸石处理的土壤蔗糖酶活性分别显著增加了7.10%、3.71%和4.33%。培养30 d，棉隆熏蒸后用沸石处理的土壤蔗糖酶活性达到最高，显著高于对照和其他处理。培养60 d，棉隆熏蒸后用生物炭处理的土壤蔗糖酶活性最高，达到64.77 mol/(g·d)，比熏蒸后用沸石处理增加了6.65%。各处理的蔗糖酶活性和对照均无显著差异。

图2 棉隆熏蒸联合生物炭和沸石处理对土壤蔗糖酶活性的影响Fig.2 Effects of dazomet fumigation combined with biochar and zeolite on soil sucrase activity

2.3 不同处理对土壤微生物数量的影响

2.3.1不同处理对土壤细菌数量的影响

从图3可以看出，在整个培养期内，棉隆熏蒸后用生物炭处理的土壤细菌数量最高，仅棉隆熏蒸处理的细菌数量最低。培养10 d，仅棉隆熏蒸和熏蒸后用沸石处理的细菌数量显著低于对照和熏蒸后用生物炭处理，熏蒸后用生物炭处理和对照无显著差异。培养30 d，棉隆熏蒸后用生物炭处理的细菌数量分别比对照、仅棉隆熏蒸和熏蒸后用沸石处理显著增加了14.10%、33.95%和18.78%，熏蒸后用沸石处理的细菌数量和对照无显著差异，但显著高于仅棉隆熏蒸处理。培养60 d，各处理间的细菌数量差异显著，棉隆熏蒸后用生物炭处理的细菌数量分别比对照、仅棉隆熏蒸和熏蒸后用沸石处理显著增加了24.59%、32.56%和28.09%。

图3 棉隆熏蒸联合生物炭和沸石处理对土壤细菌数量的影响Fig.3 Effects of dazomet fumigation combined with biochar and zeolite on the number of bacteria in soil

2.3.2不同处理对土壤真菌数量的影响

从图4可以看出，随着培养时间的延长，对照和处理组土壤中真菌数量均有所降低。培养10 d，棉隆熏蒸后用生物炭和沸石处理的真菌数量均显著低于对照，仅棉隆熏蒸处理的真菌数量和对照无显著差异。培养30 d，棉隆熏蒸后用生物炭处理和熏蒸后用沸石处理的土壤真菌数量显著低于仅棉隆熏蒸处理，分别低52.86%和41.41%。仅棉隆熏蒸处理和对照无显著差异。培养60 d，熏蒸后生物炭处理的真菌数量最高，分别比对照、仅棉隆熏蒸和熏蒸后用沸石处理高1.47、8.30倍和5.16倍。

图4 棉隆熏蒸联合生物炭和沸石处理对土壤真菌数量的影响Fig.4 Effects of dazomet fumigation combined with biochar and zeolite on the number of fungi in soil

2.4 不同处理对土壤病原菌的影响

由表3可以看出，在整个培养期内，各处理对镰刀菌和疫霉的抑制效果均较好，其中对镰刀菌的抑制效果好于疫霉。培养10 d，熏蒸后用生物炭和沸石处理的土壤中镰刀菌和疫霉的数量显著低于对照和仅棉隆熏蒸处理，其中熏蒸后用生物炭处理对镰刀菌和疫霉的抑制率达到91.04%、85.19%；熏蒸后用沸石处理对镰刀菌和疫霉的抑制率分别为74.22、84.28%。培养30 d，熏蒸后用生物炭处理对镰刀菌和疫霉的抑制率显著高于其他处理。培养60 d，熏蒸后用沸石处理对镰刀菌和疫霉的抑制率最高，分别达到89.29%和72.58%，其次是仅棉隆熏蒸处理，抑制率分别为75.90%、68.37%。熏蒸后用生物炭处理对镰刀菌和疫霉的抑制效果在培养期结束时降低，抑制率低于仅棉隆熏蒸处理。

表3 棉隆熏蒸联合生物炭和沸石处理对土壤病原菌的影响Table 3 Effects of dazomet fumigation combined with biochar and zeolite on pathogens in soil

3 结论与讨论

氮作为一种大量元素，在作物的生长中有着不可替代的作用，作物吸收利用的氮素主要是铵态氮和硝态氮[17]。我们的试验结果表明棉隆熏蒸后土壤硝态氮的含量显著增加，可能是由于熏蒸杀死的一些微生物促进了土壤氮的转化[18]。乔亚振等[19]的研究表明生物炭会降低设施土壤的全氮含量，降低土壤氮素环境风险。与乔亚振的研究结果相似，本研究发现棉隆熏蒸后添加生物炭处理在培养前期土壤铵态氮的含量降低，可能是生物炭促进了土壤微生物的恢复，土壤的矿化过程受到抑制。而棉隆熏蒸后添加沸石处理显著增加土壤硝态氮含量，这与李华兴等[20]的研究沸石可以提高土壤养分的结果一致。

棉隆熏蒸后培养10 d土壤有效磷的含量显著降低，有机质含量增加，后期均恢复至对照水平，说明棉隆熏蒸对土壤有效磷和有机质的影响是短暂的，这与方文生[21]的研究结果一致。朱婧等[9]的研究发现，在土壤中添加沸石可显著提高有效磷的含量，本试验培养10 d后发现沸石处理降低有效磷含量，可能是沸石添加量不同和土壤性质的差异造成了相反的结果。添加生物炭则显著增加速效钾和有机质的含量，效果优于沸石处理，这与李昌娟等[22]的研究施用生物炭基肥可显著提高土壤养分有效性，促进茶树对养分的吸收结果一致。土壤电导率与土壤中水溶性盐的含量有关，本试验中各处理的电导率均显著增加，其中棉隆熏蒸后添加生物炭处理比仅棉隆熏蒸的电导率高，说明生物炭可以增加土壤的含盐量，从而提高电导率。

土壤酶是土壤中的生物催化剂，土壤酶活性的高低对评价土壤肥力有重要意义[23]。过氧化氢酶催化过氧化氢的分解，减缓其对生物体的毒害，其活性与土壤理化性质密切相关[24]。蔗糖酶可增加土壤中营养物质的含量，促进养分的循环[25]。本试验表明，和对照相比，仅棉隆熏蒸和熏蒸后用沸石处理在培养的前30 d内过氧化氢酶、蔗糖酶活性增加，后期效果减弱恢复到对照水平。而熏蒸后添加生物炭过氧化氢酶活性显著增加，在培养期结束时达到最优。表明棉隆熏蒸后添加生物炭可提高土壤肥力，且作用效果较持久。谢婷婷等[26]的研究表明在尖椒生长的土壤中添加生物炭可以提高土壤中蔗糖酶、过氧化氢酶活性，且蔗糖酶活性与速效钾含量呈正相关，与我们的研究结果一致。熏蒸后用沸石处理在培养前期蔗糖酶活性提高，培养期结束时和对照间无显著差异，可能与随着培养时间延长沸石对土壤养分的促进效果不明显有关。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，它们参与大部分的生化过程和养分循环[27]。研究表明土壤熏蒸可杀灭多数微生物，降低土壤微生物的数量[28]。本研究中培养期结束时棉隆熏蒸显著降低了土壤中细菌和真菌的数量，添加生物炭处理增加了土壤微生物的数量，显著高于仅棉隆熏蒸处理组，说明生物炭有利于土壤微生物的恢复[29]。

土壤病原菌的防治对于作物生长至关重要。张大琪等[30]的研究表明，二甲基二硫熏蒸可有效防治镰刀菌，但对疫霉的防治效果较差。侯文龙等[31]发现沸石对黄瓜枯萎病菌的抑制率可达到80.3%，本试验中各处理对镰刀菌和疫霉的数量均有显著抑制作用，熏蒸后生物炭处理前期抑制率高，培养期结束时抑制率较低，可能是后期药效减弱，部分病原菌迅速繁殖。培养期结束时，熏蒸后用沸石处理对病原菌的抑制率高于其他处理组，表明沸石对土壤病原菌的抑制效果更持久，可以较长时间抑制病原菌的繁殖。

本试验首次明确了棉隆熏蒸后添加生物炭和沸石对土壤微生态和病原菌的影响，表明棉隆熏蒸后施用生物炭和沸石可以提高土壤养分、促进熏蒸后土壤微生态的恢复，并且可以加强对病原菌的防治效果，可在田间进一步推广应用。