赵威，于志勇

1 山东第一医科大学（山东省医学科学院）研究生部，济南 250117；2 山东省肿瘤医院乳腺外科

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，三阴性乳腺癌（TNBC）占乳腺癌10%～20%［1］。与其他亚型相比，TNBC 缺乏内分泌及靶向治疗机会，预后较差。铂类是TNBC 常用化疗药物，但由于化疗抵抗性和较大的不良反应，限制了它的使用［2］。因此，寻求新的治疗方案已成为医务工作者的当务之急。香附是一种传统中药，现代药理研究［3］发现，香附具有一定的抗肿瘤作用。此前，我们的课题组已证实香附乙醇提取物对TNBC 细胞具有细胞毒作用［4］，还进一步通过抗肿瘤活性实验证实香附的主要活性成分为香附烯酮，但其抗癌潜在机制以及与卡铂联合抗癌作用尚缺乏报道。有文献［5］报道，铂类化疗药杀灭肿瘤细胞的其中一个机制是激活了内质网应激通路，而外源内质网信号途径是诱导细胞凋亡的3个常见通路之一［6］。内质网负责跨膜蛋白质的成熟和正确折叠，化疗药物的干预可引起外环境缺氧和营养缺乏，致使蛋白质折叠环境受损，最终导致内质网腔内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的积累，引起内质网应激。RNA 活化蛋白激酶样内质网激酶（RNA-activated protein kinase（PKR）-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）是内质网跨膜信号转导器，错误折叠蛋白的聚集可引起PERK 的活化，进一步激活转录因子4（ATF4），以阻断错误折叠蛋白的合成，从而减轻内质网的负担，维持细胞稳态。但当内质网应激过度发生时，ATF4 可上调C/EBP 同源蛋白（CHOP），启动内质网介导的凋亡信号来诱导细胞凋亡的发生，清除受损的细胞［7］。2021 年1 月6 日—8 月28 日，本研究观察了香附烯酮与卡铂联合应用对三阴性乳腺癌细胞株MDAMB-231 增殖、凋亡的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 香附烯酮、卡铂、细胞株及试剂 香附烯酮（C15H22O）购自成都埃法生物科技有限公司。将香附烯酮粉末溶解在二甲基亚砜中（DMSO），配置成100 mmol/L 浓度储存于-20 ℃。卡铂购自大连美伦生物公司，将卡铂粉末溶解在二甲基亚砜中，配置成100µmol/L浓度，储存在-20 ℃备用。三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231购买于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，细胞培养在高糖DMEM 中，上述培养基还加入50 mL 10%胎牛血清和5 mL 100单位/mL青霉素和链霉素，在37 ℃和5%CO2的培养箱中培养。CCK-8 试剂盒购自上海碧云天生物公司，兔抗人GAPDH、BAX、Bcl-2、PERK、CHOP、抗兔IgG二抗均购自美国CST公司。

1.2 各组细胞增殖能力观察

1.2.1 各组细胞存活率测算 采用CCK-8 法。取对数期生长的MDA-MB-231细胞以8 000个/孔的密度接种于96 孔板中，每孔加入100µL 培养基，当细胞生长至融合度75%左右时，分为单纯细胞组、卡铂处理组、香附烯酮处理组、香附烯酮联合卡铂组。单纯细胞组加入DMSO，卡铂处理组加入20µmol/L浓度的卡铂，香附烯酮处理组加入0.4 mmol/L 浓度的香附烯酮，香附烯酮联合卡铂组加入20 µmol/L浓度的卡铂和0.4 mmol/L 浓度的香附烯酮。置于37 ℃恒温培养箱中继续培养24 h 后，按照说明书加入CCK-8 试剂，继续孵育2 h，使用SpectraMax i3 酶标仪测量各组450 nm 处的吸光度值，以空白孔为空白组，计算细胞存活率。细胞存活率＝（各组吸光度值-空白组吸光度值）/（单纯细胞组吸光度值-空白组吸光度值）×100%。

1.2.2 各组细胞克隆能力观察 采用细胞克隆实验。将MDA-MB-231 细胞接种于6 孔板中，每孔接种600个细胞，每孔加入2 mL 培养基，待细胞贴壁后按“1.2.1”分组方法分别加入药物处理，置于37 ℃培养箱中继续培养2 周，弃掉旧培养基，加2 mL 的4%多聚甲醛固定30 min，PBS 冲洗两次，然后加入2 mL 的1%结晶紫染色30 min，PBS 冲洗两遍，自然晾干后，使用凝胶成像仪进行拍照并观察＞50个细胞的细胞集落，计数细胞集落数。以细胞集落数表示细胞克隆能力。

1.3 各组细胞周期分布情况观察 采用流式细胞术。取MDA-MB-231细胞，按“1.2.1”分组方法分组后继续培养24 h，收集在15 mL 离心管中，加入2 mL的70%的乙醇，置于4 ℃冰箱中固定72 h，PBS 冲洗2 遍，每组加入300 mL PI 染料，避光孵育30 min，使用流式细胞仪检测各组细胞周期，并使用Modfit LT软件计算各组细胞G0/G1期、S期以及G2/M期所占比率。

1.4 各组细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。取MDA-MB-231 细胞，按“1.2.1”分组方法分组后继续培养24 h，收集在15 mL 离心管中，并每管加入5µL Annexin V FITC 和5 µL PI 染液，每组细胞再加入100µL结合缓冲液，避光孵育30 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，使用FlowJo V10 软件计算各组细胞凋亡率。

1.5 各组细胞内质网应激相关蛋白PERK、CHOP和凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2 检测 采用Western Blotting 法。取MDA-MB-231 细胞，按“1.2.1”分组方法分组后继续培养24 h，置于冰上，弃掉培养基，PBS 冲洗两次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA 强裂解液（1∶50），使用1 mL枪头刮取细胞蛋白，4 ℃条件下12 000 r/min 离心20 min，收取上清液的总蛋白，并按照说明书要求对上清液进行BCA 定量。取蛋白样品加入5×上样缓冲液（1：4），然后于100 ℃金属浴中加热5 min，自然冷却后储存在-20 ℃备用。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，常温下用5%脱脂牛奶将PVDF 膜在摇床上封闭1 h，1×TBST 洗PVDF 膜4 次，每次10 min，剪切目的蛋白对应的PVDF 膜，用PERK、CHOP、Bcl-2、BAX、GAPDH（使用一抗稀释液1∶1 000 进行稀释后）等一抗在4 ℃中孵育过夜。次日用TBST 洗涤PVDF 膜4 次后，用辣根过氧化物酶标记的二抗在摇床上孵育1 h，最后将ECL A 液和B液按1∶1配制的发光液均匀滴在PVDF膜上，使用凝胶成像仪获取相应蛋白图像，并使用Image J 软件计算各组灰度值，以灰度值表示各组PERK、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较

2.1.1 各组细胞存活率比较 单纯细胞组、卡铂处理组、香附烯酮处理组、香附烯酮联合卡铂组细胞存活率分别为96.45% ± 3.12%、49.27% ± 2.37%、52.91% ± 1.98%、30.13% ± 3.04%，其中卡铂处理组、香附烯酮处理组细胞存活率相比，P＞0.05，其余组间相比，P均＜0.05。

2.1.2 各组细胞克隆能力比较 单纯细胞组、卡铂处理组、香附烯酮处理组、香附烯酮联合卡铂组细胞集落数分别为（328 ± 18）、（204 ± 10）、（138 ± 13）、（47±5）个，组间相比，P均＜0.05。

2.2 各组细胞周期分布情况比较 各组细胞周期分布情况比较见表1。由表1 可知，卡铂处理组将MDA-MB-231细胞周期阻滞在G2/M期，香附烯酮处理组将MDA-MB-231 细胞周期阻滞在G0/G1 期，香附烯酮联合卡铂组细胞G2/M 期和G0/G1 期均发生阻滞。

表1 各组细胞周期分布情况（±s）

表1 各组细胞周期分布情况（±s）

注：与单纯细胞组相比，*P＜0.05；与卡铂处理组相比，#P＜0.05；与香附烯酮处理组相比，△P＜0.05。

?

2.3 各组细胞凋亡率比较 单纯细胞组、卡铂处理组、香附烯酮处理组、香附烯酮联合卡铂组细胞凋亡率 分 别 为1.49% ± 0.07%、33.45% ± 1.46%、33.73% ± 1.38%、64.23% ± 1.00%，其中卡铂处理组、香附烯酮处理组细胞凋亡率相比，P＞0.05，其余组间相比，P均＜0.05。

2.4 各组细胞中PERK、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量比较 各组细胞中Bcl-2、Bax、PERK、CHOP蛋白相对表达量比较见表2。由表2可知，与单纯细胞组相比，卡铂处理组、香附烯酮处理组细胞中PERK、CHOP、Bax 蛋白相对表达量显著升高，Bcl-2蛋白相对表达量显著降低（P均＜0.05）；与其它三组相比，香附烯酮联合卡铂组细胞中PERK、CHOP、Bax 蛋白相对表达量均显著升高，Bcl-2 蛋白相对表达量均显著降低（P均＜0.05）。

表2 各组细胞中PERK、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量比较（±s）

表2 各组细胞中PERK、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量比较（±s）

注：与单纯细胞组相比，*P＜0.05；与卡铂处理组相比，#P＜0.05；与香附烯酮处理组相比，△P＜0.05。

?

3 讨论

目前，TNBC 化疗耐受机制仍然未完全阐明，以往研究揭示的可能机制概括起来主要涉及以下4种：①膜糖蛋白介导途径：包括P-糖蛋白和乳腺癌多药耐药相关蛋白；②DNA 修复功能异常：以铂类等为代表的化疗药物主要通过直接损伤DNA 进而抑制细胞分裂，而肿瘤细胞DNA 修复系统活性异常升高，将使肿瘤细胞对以上药物产生耐药；③凋亡功能的缺失：细胞凋亡是化疗药物主要杀伤肿瘤细胞的途径，但乳腺癌细胞内源性或获得性的凋亡相关基因（Bcl-2基因）异常表达或功能缺陷，可造成肿瘤细胞对药物介导凋亡的抵抗，从而使化疗耐药；④微环境耐药：肿瘤微环境通过调节耐药基因表达，从而影响化疗药物的敏感性［8-11］。

近年来的研究［12-14］表明，以非传统乳腺癌药物靶点为导向的特异性针对雄激素受体的内分泌抑制剂和针对表皮生长因子受体（EGFR）及血管内皮生长因子（VEGF）的靶向酪氨酸激酶抑制剂、程序性死亡受体（PD-1）及其配体PD-L1的免疫检查点抑制剂在内的新型治疗策略在TNBC 治疗方面取得一定程度上的进展，其与标准化疗方案的联合无疑会为提高疗效、改善预后以及减轻不良反应带来潜在应用前景，但相关研究仍处在临床试验初期，真正进入临床实践阶段尚需更多循证依据。因此，以化疗为基本研究切入点，联合新型治疗药物优化传统单一化疗策略，进而改变肿瘤细胞生长的微环境，避免耐药的产生，最终实现“协同抑瘤，优势最大”是目前TNBC治疗当务之急。

中医药是一个极具潜力的宝库，有着数千年的文化积淀。香附（莎草科）在传统医学中被广泛用于治疗包括癌症在内的各种疾病［15］。我们团队通过查阅中医文献，发现香附外敷可治疗乳岩，随后团队采用UPLC-Q-TOF-MS 检测香附乙醇提取物的化学成分。体外研究发现，香附乙醇提取物以剂量依赖性抑制TNBC 细胞增殖，其机制可能与阻滞细胞周期于G0/G1 期有关，并诱导TNBC 细胞凋亡［4］。近年来研究［16-17］发现，香附提取物对卵巢癌、结肠癌、肝癌、肺癌等各类肿瘤细胞的增殖均能够显著抑制，呈现广谱的抗肿瘤活性。

本研究通过细胞毒性实验证实了香附烯酮可抑制MDA-MB-231细胞增殖能力，当与卡铂联用时，可进一步抑制MDA-MB-231 细胞增殖和克隆，表明香附烯酮可增强MDA-MB-231 细胞对卡铂的敏感性。使用流式细胞仪对细胞周期的评估显示，香附烯酮联合卡铂处理后，MDA-MB-231 细胞G0/G1 期及G2/M期均发生不同程度阻滞。

凋亡的缺失被认为是肿瘤进展的标志之一，而促进凋亡则是癌症治疗的重要靶点。我们的研究发现，香附烯酮联合卡铂可进一步增加MDA-MB-231细胞凋亡率，同时上调了凋亡标志蛋白Bax 蛋白表达，并下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平。内质网应激是介导外源性凋亡的重要途径，PERK/CHOP 介导的内质网应激是细胞外源性凋亡的一个常见途径［18-19］。Western Blotting 实验结果显示，香附烯酮可上调内质网应激相关蛋白PERK、CHOP 的表达，与卡铂联合应用时，可进一步增强香附烯酮的作用，提示香附烯酮可能通过PERK/CHOP 介导的内质网应激增强卡铂对MDA-MB-231 细胞的毒性作用。

综上所述，香附烯酮联合卡铂可抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖，促进其凋亡，其机制可能与调节内质网应激介导的细胞凋亡途径有关。本研究初步证实了香附烯酮通过PERK/CHOP 内质网应激途径介导的细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，并且可增加MDA-MB-231 细胞对卡铂的敏感性。该研究为三阴性乳腺癌的治疗开辟了新的思路，香附烯酮有望成为三阴性乳腺癌治疗的重要选择。