王海霞，林黎娟,2

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球第五大常见癌症，每年新发病例约70万人，我国发病例数占全球总病例数的55%[1-4]。NAD(P)H：醌氧化还原酶1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]是一种同源二聚体黄素酶，编码于染色体16q22，以NADH或NADPH为底物，直接将醌还原为对苯二酚[5]。NQO1的功能包括异源解毒、清除超氧物和维持内源性抗氧化维生素，因此NQO1在保护正常细胞免受氧化损伤和癌变方面起着重要作用[6]。NQO1基因或基因多态性的破坏可增加恶性肿瘤的发生风险[7-9]。因此，本实验采用RT-PCR和免疫组化染色检测HCC和正常肝组织中NQO1的表达，以验证NQO1过表达在HCC预后评估中的意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取辽东学院医学院病理与肿瘤组织库中2007～2012年术后石蜡包埋HCC组织156例，其中23例包含癌旁肝组织。156例HCC患者年龄25～77岁，平均50.4岁；男女比为121∶35；临床分期根据AJCC第6版分期标准：Ⅰ+Ⅱ期65例、Ⅲ+Ⅳ期91例。患者术前均未行化、放疗。随访截至2018年3月，109例死亡，47例存活，中位生存时间37个月。

1.2 RNA提取与qRT-PCR从辽东学院医学院病理与肿瘤组织库中选取14例HCC与10例正常肝组织新鲜标本(肝良性病变切除组织石蜡包埋后亦行后续免疫组化染色)。使用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA，通过逆转录酶引物合成第一链cDNA和低聚糖(dT)。在20 μL反应物中进行PCR反应，94 ℃预变性4 min；94 ℃ 15 min，53～58 ℃ 30 s，23～36个循环；72 ℃延长1 min，在3%琼脂糖凝胶进行电泳；用Champchemi专业图像分析系统(中国赛智公司)和LANE 1D软件对蛋白条带进行量化(中国赛智公司)。qRT-PCR是由Bio-Rad序列检测系统根据制造商的指示使用双链DNA-specific SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒(日本TaKaRa公司)进行，用比较Ct值法(2-ΔΔCt)测定基因相对表达量。NQO1：上游引物5′-GGCAGAGAGCACTGATCGTA-3′，下游引物5′-TGATGGATTGAGATTCAGC-3′；用GAPDH作为内参：上游引物5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物5′-ATACCAGGAAATGAGCTTGA-3′。实验至少重复3次。

1.3 组织芯片制作及免疫组化组织阵列块在52 ℃恒温烤箱中加热融合，用全自动组织切片机(德国徕卡公司)用全自动组织切片机以240 μm/rpm的进刀速度对组织阵列块进行切片，切片裱附在防脱片处理的进口载玻片上，阵列切片置于60 ℃恒温烤箱中烤片16 h，置于冰箱5 ℃保存。

免疫组化染色采用SP法。组织芯片常规脱蜡、梯度乙醇入水。75～85 ℃枸橼酸抗原修复液处理20 min，室温冷却45 min以上。3%H2O2处理10 min，PBS缓冲液清洗，加入一抗NQO1(1∶500)，4 ℃冰箱过夜。次日，加入免疫组化两步法检测试剂盒中的试剂1和试剂2，时间分别为25 min和30 min，经PBS清洗后，DAB显色，Mayer苏木精复染，脱水，透明，封固，镜下观察。为证明NQO1蛋白抗体免疫组化检测的特异性，应用鼠IgG代替一抗作为对照，结果为阴性；选择已知NQO1蛋白阳性的切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

结果判读：NQO1仅胞质表达模式为阳性染色。阳性细胞无或<5%为(-)，5%～25%为(+)，26%～50%为()，>50%为()，以(+～)为阳性。进一步将NQO1表达分为两组：其中(-和+)为低表达组，(和)为高表达组。

1.4 统计学分析所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。用卡方检验和Fisher精确检验评价NQO1表达与临床病理特征的相关性，Kaplan-Meier法计算肿瘤切除后的无瘤生存率和5年生存率，采用对数秩检验分析生存曲线的差异，采用Cox比例风险回归模型对单变量生存分析的所有显著特征进行多变量生存分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC中NQO1 mRNA的表达qRT-PCR检测结果显示，14例HCC中NQO1 mRNA的表达水平明显高于10例新鲜正常肝组织(P<0.01，图1)。

图1 不同肝组织中NQO1 mRNA的表达

2.2 HCC组织中NQO1蛋白的表达免疫组化结果显示，NQO1蛋白在HCC中呈严格的胞质染色模式，总阳性率为86.42%(132/156)，其中高表达率为58.97%(92/156)，明显高于癌旁非肿瘤组织(阳性率30.43%，高表达率21.74%)和正常肝组织(阳性率10.00%，高表达率10.00%)(P均<0.01，图2，表1)。

图2 NQO1蛋白在肝细胞癌及癌旁组织中的表达，SP法：A. NQO1在癌旁组织中呈()；B. NQO1在癌旁组织中呈(+)；C. NQO1在伴有血管侵犯的肝细胞癌组织中呈()；D. NQO1在不伴有血管侵犯的肝细胞癌组织中呈(+)

2.3 NQO1表达与HCC临床病理特征的关系为评估NQO1蛋白在HCC进展中的作用，本组分析了NQO1蛋白表达与HCC临床病理特征的关系。结果显示，NQO1表达与肿瘤直径(P=0.009)、pTNM分期(P=0.002)和血管浸润(P=0.001)密切相关，而与HCC患者年龄、性别、AFP水平和HBsAg状态均无相关性(P>0.05，表2)。

表2 NQO1表达与肝细胞癌临床病理特征的相关性

2.4 NQO1表达和HCC患者预后的关系采用Kaplan-Meier法分析156例HCC患者的无瘤生存率和总生存率，结果发现NQO1高表达HCC患者的无瘤生存率(Log-rank=12.168，P<0.001)和总生存率(Log-rank=13.009，P<0.001)均低于NQO1低表达者(图3)。

图3 Kaplan-Meier分析HCC中NQO1蛋白表达与患者无瘤生存率(A)及总生存率(B)的关系

为进一步证实NQO1表达在HCC进展中的重要性，本实验分析了不同pTNM分期亚组中NQO1表达与HCC患者预后的关系。在pTNM分期Ⅰ+Ⅱ期HCC中，患者无瘤生存率和总生存率与NQO1表达状态无关(P=0.204、0.177，图4A、B)。在pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期HCC中，与NQO1低表达患者相比，NQO1高表达患者的无瘤生存率和总生存率均较低(P=0.008、0.006，图4C、D)。

图4 Kaplan-Meier法联合分析肝细胞癌不同pTNM分期亚组中NQO1表达与患者无瘤生存率和总生存率的关系：A、B.pTNM分期Ⅰ+Ⅱ期中，NQO1表达与患者无瘤生存率(A)、总生存率(B)的关系；C、D.pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期中，NQO1表达与患者无瘤生存率(C)、总生存率(D)的关系

2.5 Cox比例风险回归模型分析影响HCC患者预后的因素Cox单因素分析显示，NQO1高表达HCC患者的总生存率显著低于NQO1低表达者(P=0.002)。此外，肿瘤直径(P=0.030)、pTNM分期(P<0.001)和血管侵犯(P=0.001)与总生存率相关。Cox多变量生存分析结果表明：NQO1高表达(HR：1.435，95%CI：1.014～2.032，P=0.042)、肿瘤直径(HR：1.446，95%CI：1.046～1.999，P=0.026)、pTNM分期(HR：1.823，95%CI：1.313～2.531，P<0.001)、血管侵犯(HR：1.624，95%CI：1.124～2.346，P=0.010)是影响HCC患者预后的独立危险因素(表3)。

表3 单因素和多因素分析156例HCC患者总生存率的影响因素

3 讨论

NQO1是一种重要的同型二聚体黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的酶[10]。NQO1酶可能对醌类及其代谢前体引起的致癌性、致突变性和细胞毒性具有保护作用[11-14]。NQO1酶的活性高度依赖于NQO1基因位点的多态性。在NQO1基因中已发现有93个以上的单核苷酸多态性，其中研究最广泛的是NQO1 cDNA第609位核苷酸外显子中的6处胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)转换，以及编码氨基酸序列第187位脯氨酸(P)到丝氨酸(S)的取代[15]。有研究表明，NQO1 TT基因型导致的蛋白缺乏是多泛素化和蛋白酶体系统介导的NQO1蛋白T等位基因加速降解所致[16]。与野生型基因型(CC)相比，纯合变异基因型(TT)的酶活性仅为醌还原酶活性的2%～4%，而杂合变异基因型的酶活性水平下降了3倍[17]。因此，具有NQO1 C609T同源多态性的个体可能具有发展为癌症的易感性。

最近的研究数据也表明，NQO1在HCC中表达上调与其在肝细胞癌变过程中起着重要的细胞防御作用有关[9,18]。本实验qRT-PCR检测显示，与正常肝组织相比，HCC中NQO1 mRNA水平显著升高；免疫组化结果亦显示，NQO1蛋白在HCC中的高表达率为58.97%，明显高于癌旁肝组织和正常肝组织。这与现有理论相一致，即NQO1在增殖细胞中含量较高，而在静止和终末分化细胞中含量较低[19]。

为验证NQO1表达与HCC临床及预后的关系，本组对NQO1蛋白表达和临床病理特征的关系进行分析，结果显示NQO1蛋白表达与肿瘤大小、pTNM分期、血管侵犯显著相关，而与患者AFP、HBsAg水平无关。此外，在生存率方面发现NQO1高表达HCC患者的无瘤生存率和总生存率均低于NQO1低表达HCC患者；在pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期HCC患者中，与NQO1低表达者相比，NQO1高表达者的无瘤生存率和总生存率明显降低。Cox多变量生存分析显示，NQO1表达、pTNM分期和血管侵犯是影响HCC患者总生存率的独立风险因素。因此，NQO1可以做为评价HCC患者预后的独立生物标志物。

NQO1基因作为一个氧化应激反应调节因子，在恶性肿瘤中高表达的作用机制尚不十分清楚。Asher等[20]认为，NQO1酶与TP53抑癌基因的稳定有关，并保护其不受20S蛋白酶体降解的影响，导致致癌结肠上皮细胞凋亡增加，从而阻止这些细胞发展为肿瘤状态；另外，NQO1 C609T多态性导致的NQO1活性降低可能会降低肝细胞中p53水平，减少细胞凋亡，增加基因组不稳定性，从而增加肝癌的易感性。本实验结果可以解释为NQO1在作用于某些底物时可能起到保护作用，但在作用于其他底物时可能有助于致癌。

综上，NQO1在HCC的发生、发展中起重要作用，可作为HCC预后评估的独立生物标志物。本组后续将对其主要的作用机制做深入探讨。