李琦，刘鹏，许蔷，田野，吕俊峰

（山东省农业科学院家禽研究所，山东 济南 250100）

冠 状 病 毒（Coronaviruses，CoV）于1937年被发现，分类上属套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae）。冠状病毒又分为4个属，分别为α、β、γ和δ，各种属感染的宿主范围差异较大，其中，γ属冠状病毒主要感染鸡、鸭、鹅等禽类。鸭冠状病毒是由陈贵钱等在2012年发现，随后的流行病学调查显示该病原在鸭群中的感染率约为5%。山东省是我国养鸭最多的省份，仅2020年肉鸭出栏量就高达22亿只，占全国肉鸭养殖的近40%，鸭产品出口占全国的70%以上。为了调查鸭冠状病毒（Duck Coronaviruses, DCoV）的流行情况，本研究从山东各地的养鸭场采集样品451份，用PCR方法进行检测，并对所测毒株进行遗传演化分析。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从山东各地种鸭、蛋鸭、肉鸭养殖场采集样品，样品种类包括死胚、弱雏、肠组织、棉拭子。样品具体来源及数量见表1。

表1 样品采集信息

1.2 主要试剂和引物

RNA提取试剂盒，购自杭州Axygen科技有限公司；One-Step RT-PCR SuperMix试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司。

根据GenBank中的鸭冠状病毒序列（GenBank号：JF699752）设计引物，选取病毒1b2区域，使用Primer 5软件设计，上游引物为5′- GGTGGTAGTTTGTATGTGAA-3′，下游引物为5′-GGATACCGCTTATAACACT-3′，扩增片段长度为764 bp。引物由擎科生物科技有限公司（青岛）合成。

2 方法

2.1 样品处理

将死胚和弱雏解剖，取直肠，与肠组织样品进行相同处理。取直肠/肠组织样品0.2 g于离心管中，加入1 mL生理盐水和适量研磨珠，用组织研磨器充分研磨。将研磨液转移至新的离心管，12 000 rpm离心5 min，取上清200 µL用于RNA提取。

将棉拭子样品放入离心管中，加入500 µL生理盐水，用振荡器振荡。将震荡后液体转移至新的离心管，12 000 rpm离心5 min，取200 µL用于RNA提取。

2.2 RNA提取

用RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作如下：将200 µL转移至新的离心管，加入200 µL Buffer V-L，振荡混匀，静置5 min；加75 µL Buffer V-N，涡旋混匀，12 000 rpm离心5 min；将上清转移至2 mL离心管，加300 µL异丙醇，混匀后转移至制备管中，6 000 rpm离心1 min；弃滤液，加500 µL Buffer W1A（预先加入无水乙醇）至制备管中，室温静置1 min，12 000 rpm离心1 min；弃滤液，加800 µL Buffer W2至制备管中，12 000 rpm离心1 min；将制备管转移至新的EP管中，加40 µL Buffer TE，室温静置1 min，12 000 rpm离心1 min，保存洗脱液。

2.3 PCR检测

以RNA为模板，用One-Step RT-PCR SuperMix试剂盒进行PCR检测。反应体系为20 µL，包括RNA 3 µL、上、下游引物各1 µL、2×Reaction Mix 10 µL、Enzyme Mix 0.5 µL、RNase-free Water 4.5 µL。PCR反应程序为：45 ℃，30 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次；72 ℃ 5 min。

反应产物经1%琼脂糖凝胶检测，出现条带的PCR产物送至擎科生物科技有限公司（青岛）测序。

2.4 序列分析

从GenBank中选取禽冠状病毒序列，用DNA Star软件进行同源性分析，用Mega6软件构建进化树。选取序列包括火鸡冠状病毒TCoV/IN-517/94株（GenBank号：GQ427175）和MG10株（EU095850），鸡传染性支气管炎病 毒M41/Y191株（MW222181）、M41/Y83株（MW419300）以及疫苗株H52（AF352315和H120株（ON350836），鸭冠状病毒DK2012-CoV株（KC869937）、DK/GD/27/2014（NC048214）、禽源冠状病毒D2328/15/3/13/GH株（MZ325298）、D2334/11/2/13/CI株（MZ325299）。

3 结果

3.1 引物检测结果

设计特异性引物扩增鸭冠状病毒1b2基因片段，以阳性样品进行测试，结果显示，能够扩增出与目的条带大小相似的片段（764 bp）（图1），表明所设计的引物能够用于临床样品的检测。

图1 DCoV 阳性样品检测

3.2 临床样品检测结果

用PCR方法对采集的451份样品进行检测，仅从济宁（2份）和潍坊（1份）送检样品中检测出鸭冠状病毒，总阳性率为0.67%，其中济宁地区的样品阳性率为18.2%（2/11），潍坊地区的样品阳性率为3.3%（1/30）。

3.3 冠状病毒序列分析结果

将PCR扩增到的3个片段进行测序，分别命名为DCoV WF 01株（潍坊送检样品测出）以及DCoV JN 01和02株（济宁送检样品测出），并与GenBank中已公布的部分冠状病毒的1b2基因序列进行遗传演化分析，结果显示：DCoV WF 01株、DCoV JN 01株和DCoV JN 02株位于同一分支，具有更近的遗传演化关系，但与其它毒株并不位于同一分支，遗传演化关系差异明显（图2）。

图2 冠状病毒1b2基因核苷酸序列的遗传演化分析

4 讨论与结论

鸭冠状病毒是对养鸭业危害较为严重的病原之一，掌握其在鸭群中的流行趋势对于防控该病原具有重要意义。山东作为主要的鸭养殖大省，更需要对流行病的预防和控制及时采取措施。本研究从山东各地区鸭场采集样品，用PCR方法进行检测，旨在调查了解山东养鸭地区冠状病毒的流行情况。与之前报道的冠状病毒感染率不同，本研究所测的总体阳性率仅为0.67%，证明目前山东地区鸭场养殖管理水平较高，疫病的防控措施较为严格。结合近年来新冠肺炎疫情的存在，人员流动频率降低以及人们对疫情防控的重视提高，也为动物疫病的减少提供了条件。

早期的流行病学调查结果显示，鸭冠状病毒具有发病率高、阳性率高、呈地方性流行的特点。在本次样品采集过程中，阳性样品采集地区（济宁和潍坊）并未出现冠状病毒相关疾病，据此我们推测冠状病毒可能发生变异。我们发现，分析测出的冠状病毒的1b2基因序列，与之前发现的冠状病毒相比，遗传演化关系较远。但是，鸭冠状病毒的致病性和传播特点是否发生改变，还需要后续试验进行验证。

综上所述，本研究对冠状病毒在山东地区鸭群中的流行情况进行了调查，研究结果能够为该病防控策略的调整提供数据支持。