邓南星， 白 雪， 张志伟

(南华大学衡阳医学院 1.人体形态实验中心，2.肿瘤研究所，湖南省衡阳市 421001)

肿瘤异质性普遍存在细胞间，其通过与肿瘤微环境相互作用，促使肿瘤分化形成不同细胞亚型并发生转移扩散。因此，了解肿瘤细胞的异质性对于肿瘤的诊断、明确肿瘤性质以及针对性治疗均有重要影响。传统测序技术通过对肿瘤细胞进行批量测序得到群体细胞的相关信息,反映的是细胞群的总体特征，不能特异性地了解肿瘤细胞的异质性。单细胞测序技术通过单个细胞检测肿瘤细胞的异质性、鉴定稀有细胞、划分细胞亚群、追踪细胞谱系、定位突变基因、发现新的肿瘤生物标记物等。本文将从测序技术的进展、单细胞测序技术的方法及其在肿瘤中的应用等3方面进行综述，并对其发展前景进行展望。

1 测序技术的进展

自20世纪70年代第一代测序技术(双脱氧链终止法)问世以来，目前测序技术已经发展到第四代(原位测序法)。原位测序法可用来验证已知的肿瘤分子生物标记物从而实现组织异质性的可视化，但原位测序法通常是通过对细胞群进行测序从而得到该细胞群的相关平均差异信息。

从分子角度来看，细胞是人体生命活动的基本单位，是组织构成成分。了解单个细胞的异质性，可以更好地了解疾病发生发展规律。单细胞测序技术是在单个细胞水平，对全基因组、转录组和表观遗传学的测序，其广泛应用于癌症、胚胎发育、辅助生殖、细胞分化、免疫机制、微生物等方向的研究，其在细胞亚型分类、鉴定稀有细胞、绘制细胞谱系等方面具有重要作用。

2 单细胞测序技术的步骤

2.1 单细胞分离

单细胞测序的第一步是将单个目标细胞或细胞核从组织中分离出来。即通过机械破坏或化学酶解组织制成含有目标细胞的细胞悬液，并保持细胞活力，然后在细胞悬液中将单个目的细胞分离出来，送到下游的分析中。单细胞分离要求最大程度上维持细胞的自然表达谱。目前广泛应用的单细胞分离方法有持(连)续稀释法、显微操作筛选法、激光捕获显微切割法、荧光激活流式细胞筛选法、微流控技术分离法[1]、Cell Search分离法[2]、MagSweeper分离法、CellCelector分离法以及Nanofilters分离法等九种(表1)[3]。

表1 不同单细胞分离方法的主要优缺点及适用细胞的比较

2.2 单细胞核酸的扩增

一般单细胞中RNA和DNA的含量极低(不足10 pg)，均不足以进行单细胞测序。因此进行单细胞测序前需要对目标单细胞中的超微量遗传物质核酸进行前期扩增,从而大幅提高核酸含量以便满足后续实验分析。依据核酸扩增内容不同主要分为单细胞全基因组扩增(whole-genome amplification,WGA)与单细胞全转录组扩增(whole-transcriptome amplification,WTA),相较于WGA步骤,WTA主要多了逆转录过程[3]。

目前常见的WGA依据原理不同可分为以PCR反应为基础的热循环扩增法以及不以PCR为基础的等温反应扩增法。前者主要有相关引物延伸预扩增PCR法、标签随机引物PCR、简并寡核苷酸引物PCR[4]等，后者主要有基于多次退火环状循环的扩增技术、多重替换扩增技术等。WTA法是先将RNA逆转录成cDNA后，后续步骤同WGA法[3]。

2.3 单细胞测序

单细胞测序近年来发展迅速,伴随着单细胞分离技术、核酸扩增方法及高通量测序技术的不断进步与完善，三者融合交叉逐步发展出多种单细胞测序方法。如单细胞转录组测序[3]、基于TN5转座酶染色质水平单细胞测序法[5]、单细胞全基因组文库组合索引测序[6]、单细胞染色质免疫共沉淀测序[7]等。单细胞转录组测序法细胞的RNA依次通过逆转录、核酸扩增和高通量测序后对获得的相关数据进行后续生物信息学分析[3]。

目前单细胞测序技术继续向着高质量、高通量和低成本以及多性能的方向发展，逐渐在肿瘤诊断和临床治疗等研究领域发挥着越来越重要的作用。

3 单细胞测序技术在肿瘤中的应用

肿瘤在致瘤因素作用下由正常细胞恶化增殖演化成为癌细胞，并在演变过程中不断积累突变、逐渐分化出不同的遗传谱系和亚群，从而形成了肿瘤内的异质性[8]。肿瘤存在的瘤内异质性与肿瘤的侵袭、转移能力密切相关，也影响着患者的临床诊断和治疗，但传统的测序方法对于研究肿瘤内的异质性存在诸多困难。

单细胞测序技术广泛应用于肿瘤研究中：如依托单细胞测序数据可以量化变异拷贝数从而揭示基因组多样性；揭示肿瘤细胞的分子表型，构建肿瘤进化图谱，绘制肿瘤系统发育树等[9]，从而推断出不同类型肿瘤细胞的进化过程；可识别潜在的驱动基因，发现罕见的亚克隆群体，为制定分子靶向治疗方案，预防化疗耐药和肿瘤复发具有重要意义[10]。单细胞测序技术推动基因组学研究，为研究肿瘤进化结构提供高分辨率视图，使得在单细胞水平研究肿瘤发展的分子机制成为可能。

3.1 消化系统肿瘤

Wu等[11]对来自食管鳞状细胞癌和食管腺癌患者的368个单细胞进行分析，发现这两种类型的食管癌各自具有显著的瘤内异质性和独特的内在特性。这种内在特性主要体现在各自的微环境和不同的生物标记物方面。并且两种食管癌中其相关肿瘤信号通路WNT和NOTCH也有明显不同。

Dai等[12]通过对1名结直肠癌患者的相关癌组织进行单细胞RNA逆转录组测序研究后发现该患者癌组织标本中的2 824个细胞可细分为5种不同的细胞类别，这5种细胞类型的数量差异并具有不同的功能。Wu等[13]通过对2例腺瘤性息肉的大肠癌患者进行单细胞全外显子组测序，阐述了大肠癌的分期变化过程和肿瘤内异质性。Roerink等[14]第一次在遗传、表观遗传、转录和功能水平上对来自结肠癌的多个单细胞来源的克隆进行了系统的分析，全面描述了单个癌细胞中的体细胞突变。研究发现，癌细胞亚型是根据不同增殖与迁移能力的细胞亚群来区分，具有独特增殖特征的导管细胞亚群与肿瘤浸润性T细胞的失活状态密切相关[15]。Zhang等[16]通过对56 440个胃癌及正常胃黏膜单细胞进行转录分析，构建了胃黏膜单细胞图谱，确定了可以通过HES6标记的杯状细胞识别早期肠化生。Andor等[17]通过对来自9个胃癌细胞系中数千个细胞的基因组和转录组的拷贝数变异进行分析，揭示了胃癌的体外进化规律，并在每个细胞系中均发现存在2～12个亚克隆，从而证实了胃癌细胞系中具有显著的肿瘤内异质性。

Hou等[18]通过对肝细胞癌组织样本的25个肿瘤单细胞进行单细胞三重组体测序，证实了单个肝癌细胞在基因组、DNA甲基组和转录组水平的异质性。Duan等[19]构建了不同形态学表型的HBV相关肝癌模型，通过对3例HBV相关肝癌患者的96个肿瘤细胞进行单细胞基因组测序，揭示了肿瘤异质性与组织形态学之间的联系。大部分的肿瘤是单克隆起源，而在这项研究中他们证明了一种多克隆肿瘤，即融合多结节形态的肿瘤。

3.2 肺癌

根据组织病理学分类，肺癌可分为非小细胞肺癌(鳞癌、腺癌和大细胞癌)和小细胞肺癌。小细胞肺癌发生转移较早，其恶性程度最高。因接受治疗的小细胞肺癌患者可以收集的肿瘤组织细胞较少，从而阻碍了对其基因组的相关研究。SU等[20]通过对48例小细胞肺癌患者的单个循环肿瘤细胞进行单细胞全基因组测序，推测出小细胞肺癌的发生发展过程并绘制了基因突变图谱，并证实大多数突变都可以在CTC细胞中检测到，同时发现存在明显的DNA异质性，而这种异质性可能是由于等位基因缺失造成的。Sharma等[21]通过对5例非小细胞肺癌患者利用单细胞RNA测序结合多区批量测序技术发现了一些新的亚克隆簇，这些亚克隆簇增殖速率差异存在显著性，肺癌的异质性在肿瘤间和肿瘤内是不同的。

3.3 乳腺癌

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，通常依据蛋白质标志物(雌激素受体ER、孕激素受体PR和人表皮生长因子受体HER2)的不同，将乳腺癌分为luminal A、luminal B、HGR2-enriched和三阴性乳腺癌等类型[22]。一直以来，乳腺癌的肿瘤异质性是影响临床诊断和治疗效果的关键因素，因此全面了解乳腺癌的表型和分子多样性对改善分子靶向治疗、准确判断预后和提高患者生存质量至关重要。Savas等[23]通过对乳腺癌患者分离的6 311个T细胞进行了单细胞转录组测序分析，结果发现在乳腺癌肿瘤组织中存在大量浸润性淋巴细胞且这些淋巴细胞存在明显的异质性。Karaayvaz等[24]通过对6例原发性三阴性乳腺癌(TNBC)患者的1 500多个肿瘤细胞进行单细胞转录组测序分析后发现TNBC的功能异质性与癌基因组进化存在密切关系。Wagner等[25]通过对乳腺癌癌组织处的外周血液、癌组织附近的淋巴结组织及相关正常组织进行相关单细胞测序研究，结果发现ER+/-乳腺癌患者相关组织中与PD-L1肿瘤相关的巨噬细胞和衰竭的T细胞大量表达。

3.4 宫颈癌

Yang等[26]通过对宫颈癌患者放疗前后肿瘤组织的25个宫颈细胞进行单细胞全基因组测序并对测序数据进行分析后发现放疗前后肿瘤细胞的表型差异有显著性。放疗前的肿瘤细胞中至少包含2个亚群，即主要细胞亚群Ⅰ和次要细胞亚群Ⅱ。而经过放疗后，主要细胞亚群Ⅰ中的大部分细胞发生死亡，次要细胞亚群Ⅱ损伤较少而转换为主要细胞亚群，同时NFKB1基因可以增强放射治疗的敏感性[27]。

4 总结与展望

单细胞测序技术目前已经广泛应用于发育生物学、免疫学、肿瘤的各个研究领域，极大促进了单细胞基因组学、表观基因组学、蛋白质组学的发展。随着单细胞测序技术的进步与发展，人们检测到的细胞参数、细胞类型和分子越来越多，特别在肿瘤研究领域，单细胞测序技术能有效地划分细胞群体、鉴别稀有细胞，准确描述肿瘤的进化过程，同时为癌症患者早期筛查和制定个性化临床治疗方案提供了理论依据。

单细胞测序技术及应用存在一些不足，如目前单细胞测序技术在核苷酸扩增步骤容易产生扩增偏差，出现非特异性扩增；仅适用于悬浮细胞液不能有效分析细胞或组织的相关空间信息等。近年来单细胞测序技术一直在向着高效低成本、高通量和高质量方向发展，随着相关技术不断改进，可以预见未来单细胞测序技术会变得更加精细、更加广泛适用于科研实验和临床诊断工作中。