沈娱汀，傅昭粤，宋 云，李 娟，方 亮，薛 桐，张 舒，陈丽华

(空军军医大学： 1基础医学院免疫学教研室， 2航空航天医学系航空航天生物动力学教研室，陕西 西安 710032)

现代高性能飞机具有敏捷的机动能力，能够在空中顺利完成各种复杂的高难度动作。当飞机做盘旋、觔斗和俯冲改出等动作时，飞行员受到由足向头的加速度作用，称为正加速度(+Gz)。在飞行过程中正加速度可高达+9 Gz，持续时间长达15～45 s，并可反复出现[1]，严重威胁飞行安全[2]。大量研究发现，+Gz的生理影响主要表现为机体视重增加，内脏器官沿惯性力方向发生移位和变形，血液受惯性力作用向下半身转移，从而导致多种生理功能障碍[3-4]。+Gz暴露对神经系统的影响主要表现为血液由头向下半身转移，导致脑血压下降，使脑部出现缺血缺氧的症状。学习和记忆是脑的高级功能，脑缺血缺氧会导致学习和记忆能力下降。研究表明加速度的改变会影响脑的相关功能[5-6]。既往研究发现，在小鼠和大鼠模型中，+Gz刺激会导致空间学习能力以及记忆力的变化[7-9]。为应对高+Gz暴露所带来的不良影响，飞行员会通过预先+Gz的暴露训练来提高其+Gz的耐受能力，进而降低执行任务时高+Gz所带来的影响[10]。

既往关于+Gz影响机体生理功能的研究较多，但+Gz重复暴露对机体认知和心理状态影响的研究尚不多见[11]。因此，研究高+Gz重复暴露对学习记忆功能的影响及其相关机制尤为重要。本研究以连续性暴露于+15 Gz条件下的小鼠为研究对象，通过行为学实验检测+15 Gz重复暴露后小鼠空间学习能力、焦虑恐惧心理状态和场景性恐惧记忆能力的变化，旨在为进一步探究+Gz重复暴露对飞行安全的影响提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性6～8周C57BL/6小鼠，体质量18～22 g，SPF级，购自空军军医大学动物实验中心。实验共分为两组：+15 Gz组(+15 Gz离心15 min/d，连续7 d)和对照组(同窝小鼠不进行高+Gz离心)，每组各9只。本研究经空军军医大学伦理审查委员会批准(许可证编号：20180101)。

1.2 方法

1.2.1 +Gz暴露 采用动物离心机进行+Gz暴露，利用小鼠固定器将小鼠水平固定于离心机的转臂上，头部朝向离心机转臂轴心。+15 Gz组小鼠进行+15 Gz暴露，峰值作用时间为15 min。对照组小鼠仅放置于固定器中15 min，但不进行+Gz暴露。小鼠完成连续7 d，每天暴露24 h后，进行后续实验。

1.2.2 水迷宫实验 运用水迷宫实验检测小鼠的空间学习和记忆能力，由位于水池正上方的摄像机记录每只小鼠的游泳活动，使用视频跟踪系统用来收集小鼠运动数据，包括逃避潜伏期、游泳距离及在目标象限中的总游泳时间。其中逃避潜伏期和游泳距离用于评估小鼠空间学习能力；在目标象限中的总游泳时间用于评估小鼠的记忆能力。实验训练阶段在隐蔽平台实验中连续进行6 d，每日训练4次。训练时，将小鼠面向池壁从4个入水点分别放入水中，记录小鼠从入水到找到水中平台并站立其上所需时间，称为潜伏期。小鼠找到平台后，让其站立在平台10 s。若入水60 s后小鼠仍未能找到平台，则将其轻轻从水中拖上平台，并停留10 s，然后进行下一次训练。在第7日撤除平台，将小鼠由原先平台象限的对侧放入水中自由探查60 s，记录动物在目标象限(原先放置平台的象限)总游泳时间和进入该象限的次数，以评估其记忆保留能力。

1.2.3 旷场实验 旷场实验用来反映小鼠对陌生环境的探索和伴随的情绪变化，进入旷场这一陌生环境后，小鼠对新环境的恐惧会使其主要在旷场周边区域活动，而小鼠的探索特性又促使其产生在中央区域活动的动机，因此在中心区域的运动距离及停留时间能够代表小鼠的焦虑恐惧情况。场地由一个方形的黑色有机玻璃盒子组成(30 cm×30 cm×25 cm)，中心区域15 cm×15 cm。实验开始时，每只小鼠被放入同一个角落，并在其中适应1 min。随后进行摄像和计时，观察5 min内小鼠的总运动距离、中心区域运动距离以及中心区域停留时间。

1.2.4 高架十字迷宫实验 高架由两个相对开臂和两个相对闭臂组成，闭臂的上部是敞开的。实验开始时，将小鼠从中央区域面向闭臂放入迷宫，然后释放它们自由探索迷宫5 min，并记录小鼠进入开臂和闭臂的次数以及总时长。由于小鼠天生害怕开阔的空间，因此进入开臂的次数和时长能够用来判定小鼠的恐惧和焦虑情绪。

1.2.5 场景性恐惧条件化模型检测 僵立为小鼠表达恐惧的方式，表现为除呼吸外的肢体活动均消失，其总的僵立时间与恐惧记忆的强弱呈正相关。人们常用僵立时间占总测试时间的百分比来表示小鼠的恐惧程度。实验过程共分为适应、训练和测试3个阶段。第1日为适应阶段，即将两组小鼠分别放入恐惧箱中适应10 min，不加任何处理。第2日为训练阶段，训练时首先将小鼠分别放于恐惧箱中适应1 min，随后间断给予5次足底电击(1 s，0.8 mA)，每次间隔60 s，完成后在箱内停留1 min放回饲养笼。第3日为测试阶段，训练结束24 h后将小鼠分别放于恐惧箱中，不给予任何刺激自由活动5 min，由图像自动采集系统追踪记录小鼠的活动及僵立时间。每只小鼠实验结束后均需用750 mL/L乙醇擦拭场地，充分晾干。

2 结果

2.1 水迷宫实验结果

+15 Gz连续7 d暴露24 h后，我们运用水迷宫实验对小鼠的空间学习以及记忆能力进行检测。结果显示，随着训练时间的延长，无论是对照组还是+15 Gz组，小鼠的逃避潜伏期以及游泳距离均呈现下降的趋势，表明水迷宫训练有效。与对照组相比，在训练的第5日和第6日+15 Gz组小鼠的逃避潜伏期和游泳距离明显降低且差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，图1 A～B)，说明+15 Gz暴露后小鼠的空间学习能力增强。此外，在水迷宫训练的第7日通过无平台空间探索实验发现，与对照组相比，+15 Gz组小鼠在目标象限中的总游泳时间明显升高，差异有统计学意义(P<0.01，图1C)，表明+15 Gz暴露增强了小鼠的记忆能力。图1D为水迷宫训练时两组小鼠的代表性游泳轨迹。以上结果证实，持续的+15 Gz暴露能够增强小鼠的空间学习和记忆能力。

A：连续6 d训练中小鼠的平均逃避潜伏期(n=6， bP<0.01 vs对照组)；B：连续6 d训练中小鼠的平均游泳距离(n=6， aP<0.05 vs对照组)；C：小鼠在目标象限中的总游泳时间(n=6， bP<0.01 vs对照组)；D：水迷宫训练时两组小鼠的代表性游泳轨迹(大圆代表水池，绿色圆圈代表隐藏平台)。图1 水迷宫实验结果

2.2 旷场实验结果

为了研究+15 Gz暴露对于小鼠焦虑和恐惧情绪的影响，我们在连续7 d，每日24 h +15 Gz暴露后对对照组以及+15 Gz组小鼠进行了旷场实验。在中心区域花费的时长以及总的活动距离被用于判定小鼠的焦虑和恐惧状态。与对照组相比，+15 Gz组小鼠处于中心区域的时间明显延长且差异有统计学意义(P<0.01，图2A)，而其总的活动距离无显著差异和变化趋势(图2B)。以上结果表明，持续的+15 Gz暴露能够减少小鼠的焦虑恐惧情绪。

A：小鼠在中心区域花费时长(n=6， bP<0.01)；B：小鼠的总活动距离(n=6)。图2 旷场实验结果

2.3 高架十字迷宫实验结果

为了进一步证明+15 Gz暴露对于小鼠恐惧和焦虑情绪的影响，高架十字迷宫实验检测了对照组和+15 Gz 组小鼠进入开臂和闭臂的次数以及总时长。研究发现，+15 Gz组小鼠处于开臂的时间明显延长(P<0.01，图3A)，而处于闭臂的时间与对照组相比无明显差异(图3B)。此外，在进入开臂和闭臂的次数方面，+15 Gz组小鼠进入开臂的次数明显增多(P<0.01，图3C)，而进入闭臂的次数则无显著差异(图3D)。这些结果证明，持续+15 Gz暴露后能够显著减少小鼠的恐惧和焦虑情绪。

A：小鼠进入开臂的总时间(n=6， bP<0.01 vs对照组)；B：小鼠进入闭臂的总时间(n=6)；C：小鼠进入开臂的总次数(n=6， bP<0.01 vs对照组)；D：小鼠进入闭臂的总次数(n=6)。图3 高架十字迷宫实验结果

2.4 场景恐惧实验结果

通过旷场和高架十字迷宫实验对小鼠的焦虑和恐惧情绪进行评估后，为进一步探究小鼠的恐惧记忆能力，我们对对照组和+15 Gz组小鼠进行了场景恐惧实验。僵立为小鼠表达恐惧的行为方式之一，表现为除呼吸外其他的肢体运动均消失，其总时长称为僵立时间，僵立时间的长短与恐惧记忆的强弱呈正相关。足底电击后24 h进行场景恐惧记忆检测，发现与对照组小鼠相比，+15 Gz组小鼠总僵立时间以及10 min内僵立时间百分比均显著降低(P<0.01)，而僵立次数无明显差异(图4A～C)。表明持续+15 Gz暴露后小鼠的场景性恐惧记忆能力下降。

A：小鼠的总僵立时间(n=9， bP<0.01 vs对照组)；B：小鼠的僵立次数(n=9)；C：10 min内僵立时间百分比(n=9， bP<0.01 vs对照组)。图4 场景恐惧实验结果

3 讨论

随着高性能战斗机的大量列装，持续性+Gz暴露可能诱发的安全问题已成为航空医学领域的研究重点[12]。学习和记忆是动物和人类赖以生存的重要脑功能，既往研究发现高强度+Gz单次或重复暴露可导致动物出现学习功能受损和记忆功能障碍，严重时可导致脑不可逆性损伤[13]。但是有关+Gz对于小鼠心理状态影响的研究报道尚不多见。在本研究中，我们通过动物离心机对小鼠进行+15 Gz离心15 min/d，连续7 d的处理。在完成重复暴露24 h后，运用行为学实验研究+15 Gz重复暴露对小鼠学习记忆和焦虑恐惧情绪的影响。水迷宫实验是用来检测小鼠学习和记忆能力的一种方法，通过训练时的逃避潜伏期和游泳距离判断小鼠的空间学习能力，利用无平台探索时在目标象限的游泳时间评估小鼠的记忆能力。本实验结果显示，与对照组相比，+15 Gz组小鼠在训练第5日和第6日的逃避潜伏期及游泳距离明显降低，同时在目标象限的游泳时间延长，表明+15 Gz连续暴露能够显著增强小鼠的空间学习和记忆能力。在旷场实验中，在中心区域花费的时间和活动距离被用于判定小鼠的焦虑状态。研究发现，相比于对照组，+15 Gz组小鼠在中心区域花费的总时间延长，而其活动距离无明显差异，提示+15 Gz连续暴露能够减少小鼠的焦虑样行为。高架十字迷宫实验主要反映小鼠的恐惧和焦虑情绪，基于小鼠天生害怕开阔空间这一特点，小鼠进入开臂的次数和时长能够用来检测小鼠的恐惧和焦虑状态。结果显示，+15 Gz组小鼠进入开臂的次数和总时长明显增多，而进入闭臂的次数和时长无明显差异，说明+15 Gz连续暴露能够减弱小鼠的恐惧和焦虑情绪。在场景恐惧实验中，僵立时间占总测试时间的百分比常用来表示小鼠的恐惧程度。实验发现，与对照组相比，+15 Gz组小鼠总僵立时间和僵立时间占总测试时间的百分比显著降低，提示+15 Gz连续暴露能够降低小鼠的场景恐惧记忆能力。

在本次实验中，+Gz对于机体学习和记忆能力的影响结果与以往研究报道结果有所差异[14-16]。既往研究表明，实验对象在高+Gz作用下，其学习记忆能力均显著下降，而本次的研究发现在+15 Gz连续暴露7 d后，小鼠在后续的水迷宫训练中表现出空间学习和记忆能力增强，其可能的原因主要有两点：一是实验对象不同，既往研究中大多采用大鼠作为研究对象，小鼠和大鼠对于+Gz的耐受能力不同，小鼠的半数致死量为20 G，而大鼠的半数致死量只有10.19 G，小鼠的+Gz耐受能力远高于大鼠[17]。以往研究常对大鼠进行+10 Gz暴露，已达到大鼠的耐受极限[18]。而本次实验的+15 Gz对小鼠来说处于生理耐受范围之内，尚未达到耐受极限。二是实验方法不同，既往研究中，对大鼠进行+Gz重复暴露时间间隔较短，一般采用1 d之内连续暴露多次，且在暴露完成后即刻开展行为学检测[19-20]。而在本研究中，对小鼠进行+15 Gz暴露15 min/d，连续7 d的处理，暴露完成24 h后才进行心理状态的检测和与认知检测相关的训练工作，这也是造成本研究结果与既往报道有所差异的重要原因。

在+15 Gz暴露对于小鼠心理状态影响方面，本研究发现连续7 d +15 Gz暴露后小鼠的焦虑与恐惧情绪减弱，同时其场景恐惧记忆能力下降。分析其原因，可能是由于在给予小鼠正常生理耐受范围内的高强度连续刺激之后，小鼠对高强度刺激逐渐适应并产生了一定程度的耐受[21]，随后再对其进行低强度刺激(如高空、旷场和电击等)时小鼠心理承受能力增强，表现出的焦虑及恐惧行为减少，其具体原因及机制还有待进一步阐明。既往研究多数集中于+Gz暴露时或暴露后即刻对认知功能的影响及其机制，而本次研究发现小鼠+15 Gz重复暴露后当其再次处于水迷宫建立的危险环境中时，实验组小鼠能够较快地适应低强度威胁的挑战，在训练后期表现出较对照组显著优异的学习和记忆能力，这是否是由于+15Gz重复暴露后小鼠的焦虑和恐惧状态变化所带来的继发效应，也有待于进一步研究阐明。综上所述，本研究结果表明，一定强度的+Gz重复暴露刺激对小鼠的心理和认知能力可能存在正性调控作用，这对指导相关训练提供了新的思路与数据支撑，具体调整机制值得深入研究。