陈传玉，谭樊杰，殷平，张德林

作物遗传改良全国重点实验室/湖北洪山实验室/华中农业大学生命科学技术学院，武汉 430070

植物和细菌处于营养胁迫时，会产生一种由核苷酸代谢产物（pp）pGpp诱导的严谨反应[1]，即氨基酸饥饿时发生蛋白合成及相关基因表达停滞的反应[2-3]。信使分子（pp）pGpp，也被称为警报素分子，是细菌和植物生存所必需的。信使分子（pp）pGpp主要分为3种：鸟苷五磷酸（pppGpp，G5P）、鸟苷四磷酸（ppGpp，G4P）和鸟苷三磷酸（pGpp，G3P）。（pp）pGpp与GTP结构非常相似，在五碳糖的5′依次递减一个磷酸基团，五碳糖的3′焦磷酸基团被一个羟基取代。

（pp）pGpp作为常用的信号传递分子[4]，对许多病原菌（例如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）的黏附[5]、侵入[6]、免疫逃避、传播、生物膜形成[7]和慢性感染[7]起着重要作用。鞭毛是大多数细菌黏附宿主细胞的关键。（pp）pGpp能够通过抑制病原体鞭毛基因的表达，从而影响病原体入侵。（pp）Gpp通过产生毒素和调节生物膜形成在免疫逃避和细菌传播中发挥作用[8]。由于信使分子（pp）pGpp对细菌和病原体的毒性、致病性的特殊作用，使其可能成为一种潜在的新型的抗菌药物[9-11]。

在细菌中，主要由3种信使分子合成酶（RelA、GppA、YvcI）负责催化合成（pp）pGpp[12]。细菌中（pp）pGpp的合成和水解主要由双功能RSH代谢酶（例如RelA）决定，RSH合成酶活性过高，（pp）pGpp水平升高，激活应激反应，抑制细胞生长和基因表达。RSH水解酶使（pp）pGpp水平过低，细胞不能对营养胁迫产生适当的反应。而RSH酶特有的严谨反应不存在哺乳细胞中，因此，利用（pp）pGpp类似物抑制细菌生长为开发新的抗菌药物提供了可能。尽管（pp）pGpp被发现已有近50年的历史，但是（pp）pGpp的代谢和信号传递过程仍是关注的重点。近年来，蓝细菌中的（pp）pGpp代谢机制逐渐被人们发现，可能与现有的代谢调控有所差异。由于蓝细菌是具有叶绿体的放氧光合性细菌，其类似的RSH活性调控机制为日益严重的蓝藻水华治理提供了可能。

现有的研究中，（pp）pGpp主要来源于植物和细菌的内源提取以及酶生物合成[13-14]，具有操作复杂、成本高昂、使用有毒试剂的弊端，无法满足快速获得大量的（pp）pGpp的需求。因此，本研究以体外酶合成（pp）pGpp的方法为基础，建立和优化新的生物合成（pp）pGpp体系，以期为相关生化和微生物学研究高效提供物质保障。

1 材料与方法

1.1 菌 株

所需菌株为大肠杆菌BL21（λDE3）和DH5α，枯草芽孢杆菌168 strain。其中，信使分子（pp）pGpp合成酶的基因（relA、gppA）序列来源于大肠杆菌BL21（λDE3），yvcI来源于枯草芽孢杆菌168 strain。蛋白表达纯化使用大肠杆菌BL21（λDE3），质粒扩繁使用大肠杆菌DH5α。

1.2 主要试剂和仪器

1）分子克隆。引物合成和测序由武汉擎科生物有限公司完成，dNTP购买于New England Biolabs公司，Pfu和Taq酶由华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室Yin Lab提供。普通DNA产物回收试剂盒（DP204-02）和普通质粒小提试剂盒（DP103-02）购自天根生化科技（北京）有限公司。

2）蛋白纯化试剂。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（B546018）、Tris SDS pH 6.8（B546022）、Tris SDS pH 8.8（C526033）购自生工生物工程股份有限公司、Tris（V900866）、NaCl（V900058）、咪唑（V900153）购买于Sigma公司。

3）信使分子合成试剂。ATP（A600020）和GTP（A620250）购于生工生物工程股份有限公司，Tris、MgCl2、NaCl试剂均购买于Sigma公司。

4）主要仪器。蛋白纯化仪（ÄKTA™pure 25，GE Healthcare）、制冷型台式真空离心浓缩仪（北京中科科尔仪器有限公司）。

1.3 质粒构建

负责合成（pp）pGpp的3种酶基因来源于大肠杆菌BL21（λDE3）和枯草芽孢杆菌（168 strain）。将大肠杆菌 BL21（λDE3）和枯草芽孢杆菌（168 strain）菌株分别涂布无抗生素的LB平板，培养6～8 h；随后挑取多菌落于50 μL超纯水，100℃煮5 min破碎细胞壁，12 000 r/min离心5 min后，取5 μL的上清作为模板进行PCR反应，获得DNA片段；将DNA片段装载于pET15D或pET21b，进行菌落PCR反应，选取阳性克隆测序，确定基因序列，进行质粒提取。

1.4 大肠杆菌培养

将构建好的质粒转入大肠杆菌BL21（λDE3）感受态细胞中，接入10 mL含有相应抗性的LB培养基中，于37℃、200 r/min摇床培养12 h。再按照1∶100的比例将其接入1 L LB培养基中，200 r/min、37℃培养4～5 h至OD600达到1.0左右；将温度降至16℃诱导14～16 h。

1.5 蛋白纯化

使用高压破碎的方式破碎细菌，使细菌细胞壁和细胞膜破碎，释放胞质中的蛋白。破碎好的菌液，14 000 r/min 4℃冷冻离心1 h，离心后取上清。因pET15D载体的N端融合6×His纯化标签或pET21b载体C端融合8×His纯化标签，通常使用Ni柱亲和层析获得目的蛋白，随后进一步使用Source Q 10-100进行纯化，获得高纯度的信使分子（pp）pGpp合成酶。

1.6 酶活反应

以ATP和GTP为原料，通过RelA催化合成G5P，再由焦磷酸激酶GppA水解G5P生成G4P，最后磷酸水解酶YvcI水解G5P或G4P生成G3P。

1）RelA的催化反应。RelA以ATP和GTP为原料，将底物ATP-5′端的焦磷酸转移到GTP的3′端上，取代羟基的位置，合成产物AMP和pppGpp。

2）GppA的催化反应。GppA以pppGpp为底物，降解其5′端的γ-磷酸基团，催化生成产物ppGpp。

3）YvcI的催化反应。YvcI以pppGpp和ppGpp为底物，降解5′端的γ和β-磷酸基团，催化生成产物pGpp。

RelA1-400以ATP和GTP为底物，于37℃反应30 min后使用Source Q 10-100进行分离纯化，获得G5P。随后GppA以G5P为底物催化生成G4P。经验证YvcI以G5P和G4P作为底物，催化合成G3P。

1.7 终止反应

于95℃终止反应，避免使用苯酚等试剂危害人体，同时将蛋白酶变性形成沉淀，除去蛋白等杂质，为进一步提纯信使分子做准备。

1.8 信使分子(pp)pGpp分离提纯

与传统信使分子提取分离不同，不需要使用有机试剂萃取，采取更为环保安全的方式进行纯化。根据底物和产物所带电荷不同，利用Source Q 10-100对信使分子进一步分离提纯，其中A buffer：25 mmol/L Tris pH 8.0，B buffer：25 mmol/L Tris pH 8.0，1 mol/L NaCl。

1.9 冻 干

利用脱盐柱将纯化后的信使分子置换到需要的超纯水中，随后使用制冷型真空离心浓缩仪，将信使分子浓缩冷冻成干粉，可于-80℃长期保存。

1.10 浓度测定

2 结果与分析

2.1 酶的体外表达纯化

将负责合成（pp）pGpp的3种酶基因relA、gppA、yvcI，从E.coliBL21（λDE3）和Bacillus subtilis168 strain基因组中克隆到pET15b或pET21D载体上，进行蛋白表达和纯化。如图1所示，经镍柱亲和层析和离子交换层析，3种信使分子合成酶蛋白纯度高、性质稳定，可用于信使分子的体外合成。

2.2 信使分子合成酶活性测定

RelA以ATP和GTP为原料，催化ATP的5′端β位磷酸基团断裂，转移到GTP的3′端取代羟基，合成信使分子G5P（图2A）。GppA催化G5P的5′端γ位磷酸断裂合成G4P（图2B），YvcI以G5P或G4P为底物，催化合成产物G3P（图2B）。

图2 信使分子合成酶活性测定Fig.2 Messenger molecular synthase activity assay

2.3 不同条件对产物得率的影响

1）pH对信使分子G5P合成的影响。反应体系中的pH依次为Bis-tris pH 6.0，Tris-HCl pH 7.0、8.0、9.0，Glycine pH 10.0，RelA1-400用不同的pH稀释100倍，浓度为1 μmol/L。如图3所示，G5P合成量随pH升高逐渐升高，pH=9时G5P产量最高，RelA1-400的活性最强，pH=10时G5P产量反而降低，RelA1-400的活性降低。

图3 pH对信使分子G5P合成的影响Fig.3 The effect of pH on the synthesis of the messenger molecule G5P

2）金属离子对信使分子G5P合成的影响。如图4所示，在 Tris-HCl pH 9.0、RelA1-400浓度为 1 μmol/L的反应体系中，探索金属离子Ca2+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+对信使分子G5P合成的影响。结果显示，RelA1-400在含有Ca2+、Ba2+、Zn2+的反应体系中，无催化活性，不合成G5P；RelA1-400在Mg2+存在下，合成效率最高，G5P的产量最高。

图4 金属离子对信使分子G5P合成的影响Fig.4 Effects of metal ions on the synthesis|of messenger G5P

3）反应时间对信使分子G5P合成的影响。如图5所示，在Tris-HCl pH 9.0、添加Mg2+、RelA1-400浓度为1 μmol/L的反应体系中，在5～120 min随时间延长G5P的产量逐渐增加。为缩短反应时间，提高合成效率，下文探索G5P合成酶的浓度。

图5 反应时间对信使分子G5P合成的影响Fig.5 The effect of reaction time on the synthesis of messenger molecule G5P

4）酶浓度对信使分子G5P合成的影响。在Tris-HCl pH 9.0、添加Mg2+、反应时间为10 min的反应体系中，探索 1、2、4、6、8 μmol/L 酶浓度对信使分子G5P合成的影响（图6）。结果显示，酶浓度在2、4、6 μmol/L时RelA1-400的活性最高，G5P的合成量最高；随着酶浓度升高，G5P的产量反而降低。为提高反应效率，减少反应体系中的蛋白酶，提高信使分子的纯度，选择2 μmol/L的RelA1-400作为最佳反应酶浓度。

图6 酶浓度对信使分子G5P合成的影响Fig.6 The effect of enzyme concentration on the synthesis of the messenger molecule G5P

5）反应时间对信使分子G4P合成的影响。为提高合成效率，在RelA催化合成反应10 min后，直接加入GppA或YvcI继续反应合成G4P或G3P。这样，只需一步纯化就可以获得目标产物，避免了二次纯化的损失。因此，本研究在RelA1-400合成G5P的基础上，探索优化合成信使分子G4P、G3P的方法。在Tris-HCl pH 9.0、添加Mg2+、2 μmol/L RelA1-400反应10 min后，继续添加1 μmol/L GppA参与反应，探索反应时间对信使分子G4P合成的影响（图7）。结果显示，随时间延长，信使分子G4P的产量逐渐升高。为提高合成效率，选取反应时间20 min，继续优化GppA酶浓度。

图7 反应时间对信使分子G4P合成的影响Fig.7 The effect of reaction time on the synthesis of messenger molecule G4P

6）酶浓度对信使分子G4P合成的影响。在Tris-HCl pH 9.0、添加 Mg2+、2 μmol/L RelA1-400反应 10 min后，继续添加GppA参与反应20 min，探索了不同的酶浓度对信使分子G4P合成的影响（图8）。结果显示，随GppA的浓度升高，信使分子G4P的产量逐渐升高，添加6 μmol/L GppA反应20 min，信使分子G4P的产量最高。

图8 酶浓度对信使分子G4P合成的影响Fig.8 The effect of enzyme concentration on the synthesis of messenger G4P

7）反应时间对信使分子G3P合成的影响。在Tris-HCl pH 9.0、添加Mg2+、2 μmol/L RelA1-400反应10 min后，继续添加 1 μmol/L YvcI参与反应，探索不同反应时间对信使分子G3P合成的影响（图9）。结果显示，随反应时间延长，信使分子G3P的产量逐渐升高。添加1 μmol/L YvcI反应20 min后，底物基本消耗完。

图9 反应时间对信使分子G3P合成的影响Fig.9 The effect of reaction time on the synthesis of messenger molecule G3P

8）酶浓度对信使分子G3P合成的影响。如图10所示，在Tris-HCl pH 9.0、添加 Mg2+、2 μmol/L RelA1-400反应10 min后，继续添加YvcI参与反应20 min，探索不同酶浓度对信使分子G4P合成的影响。结果显示，随YvcI的浓度升高，信使分子G3P的产量逐渐升高，添加4 μmol/L YvcI反应20 min后，信使分子G3P的产量最高。

图10 酶浓度对信使分子G3P合成的影响Fig.10 The effect of enzyme concentration on the synthesis of messenger G3P

2.4 制备小分子的适用范围测定

（pp）pGpp信使分子参与嘌呤合成通路，与嘌呤合成蛋白结合（Gmk）并抑制其功能。蛋白样品中不能存在DTT，所以纯化蛋白全程不添加DTT，并且分子筛纯化时，补加10 mmol/L MgCl2（即25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2），与此同时冻干的信使分子也溶解于此试剂。采用信使分子滴定嘌呤合成蛋白的方法（20∶1）进行ITC（isothermal titration calorimetry）实验。ITC验证了嘌呤合成蛋白（Gmk）与信使分子（pp）pGpp发生了强烈互作（图11），说明信使分子（pp）pGpp可以应用于生化分析。

2.5 合成通路的优化

如图12所示，与传统的合成方法相比，新的合成方法只需要将反应产物经离子交换柱进行分离纯化，除去多余的底物和产物，随后将得到的信使分子置换到超纯水中，冻成干粉即可。此方法简单快速，不需要任何有毒试剂，安全环保。

图11 信使分子（pp）pGpp与Gmk的互作验证Fig.11 Interaction verification of messenger molecule（pp）pGpp and Gmk

图12 合成通路优化Fig.12 Synthetic pathway optimization

2.6 成本对比分析

合成信使分子成本对比分析结果（表2）显示，与商业化购买的信使分子相比，合成信使分子（pp）pGpp的成本降低了96%。

表2 合成信使分子成本对比分析Table 2 Comparative analysis of the cost of synthetic messenger molecules

3 讨论

选择合适的pH和金属离子是信使分子合成酶发挥功能的关键，但其他因素也是影响信使分子体外合成的重要因素。体外合成信使分子容易出现蛋白杂质，因此，本方法在终止反应时，为使蛋白变性而不引入其他有机试剂，防止其他杂质对信使分子纯度的影响。另外，本研究体外合成的信使分子经验证，可以运用到ITC分析。Takahashi等[13]从拟南芥中提取信使分子，采用甲酸、甲醇等具有强腐蚀性和毒性的试剂进行信使分子的萃取，进一步进行HPLC纯化获得信使分子。与其相比，本研究建立的体外合成方法，具有以下优势：一是方法简单，不需要特殊的有毒试剂；二是原料简单，常用的ATP、GTP即可参与反应；三是无需任何冰上或者4℃操作，室温操作即可；四是反应时间大大缩短。