张艺帆， 缪潇瑶， 肖炳坤， 杨建云， 董艺普， 黄荣清*

(1.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所， 北京 100850； 2.广东药科大学中药学院， 广州 511436)

保元汤源自明代孙志宏所著《简明医彀》，全方组成为：人参一钱，黄芪二钱，甘草五分，肉桂二分，加生姜一片，水煎服。人参、黄芪大补元气，扶助心气；甘草炙用，甘温益气，通经利脉，行血气；肉桂辛热补阳，温通血脉，全方以益气、补虚、培元为主，主治元气虚弱之证。《张氏医通·祖剂》将此方列为补气类诸方之首[1]，并被《古代经典名方目录(第一批)》所收录。研究表明，保元汤具有保护心血管系统的药理活性，可用于治疗冠心病[2]、心肌梗死[3]和慢性心衰[4]等心血管疾病，对心肌细胞具有一定保护作用[5-6]。同时该方可调节免疫功能[7]，抗缺氧[8]，临床上常与他方合用治疗气虚血瘀引起的多种病症[9-10]。

目前有关中药复方的疗效及优势大多来源于临床经验的总结。代谢组学通过考察生物体受到外界刺激或扰动前后的变化，追溯至代谢通路和代谢网络，进而阐明疾病的发生发展及药物的作用机制[11]，强调系统的整体性和动态性。基于疾病和药物干预下的代谢网络的变化来评价中药复方的整体效应[12]，其全景式、综合性和整体互动性与中药多组分、多靶点、整体调节的特点不谋而合。代谢组学已越来越多被应用到中药配伍的药效研究中[13]。

血虚证是指因血液亏虚，脏腑、经络、组织失于濡养而表现出来的虚证，是中医临床常见证候之一[14]。目前仅依靠单一成分或生化指标难以全面解释血虚证治疗机制。研究表明，环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)通过杀伤免疫细胞(特别是白细胞)从而导致机体免疫功能低下[15]，注射CTX可显著抑制动物胸腺、脾脏功能[16]，改变小鼠血清代谢轮廓[17]。现采取腹腔注射CTX建立免疫抑制模型，模拟中医症候血虚证的病理情况，选择四物汤作为阳性对照药[18]，运用基于气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)的代谢组学技术观察造模后小鼠代谢轮廓的改变，对保元汤在血虚证小鼠模型中的干预作用以及相应的差异性代谢物进行研究。从分子水平分析代谢通路并阐述其作用机制，进而评价中药复方保元汤治疗血虚证的整体药效，以期为古典名方的现代开发和应用提供一定的参考，在中医治疗血虚证及代谢通路的阐释方面具备一定的新颖性和前瞻性。

1 仪器、试药与实验动物

1.1 仪器

GCMS-QP2010SE气相色谱与质谱联用仪(日本岛津公司)，NV-15G 氮气吹干仪(成都塞斯特仪器仪表有限公司)，LGJ-25C冷冻干燥机(四环科学仪器有限公司)，高速冷冻离心机(美国赛默飞科技有限公司)，BC-2600Vet兽用全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗国际股份有限公司)。

1.2 药品与试剂

红参、黄芪(厦门半山农网络科技有限公司)，肉桂(亳州市永刚饮片厂有限公司，批号：200824)，炙甘草(安徽道源堂中药饮片公司，批号：200501)，四物颗粒(四川吉泰安药业有限公司，批号：1911043，规格：5 g/袋)。

注射用环磷酰胺(德国Baxter Oncology GmbH公司，批号：6C105A，规格：0.2 g/瓶)，庚烷、甲氧胺盐酸盐购自TCI上海化成工业发展有限公司，双三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、甲醇、乙腈购自美国Sigma-Aldrich公司，普通氮气(纯度≥99.2%)、高纯氦(纯度≥99.999%)购自北京环宇京辉京城气体科技有限公司。

1.3 实验动物

SPF级昆明种(KM)小鼠48只，雄性，4～6周龄，体重18～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。饲养温度为23～25 ℃，饲养环境湿度为45%±10%。

2 方法

2.1 保元汤方剂制备

参考《古代经典名方目录(第一批)》中保元汤的配比(一剂中含人参3 g、黄芪9 g、炙甘草3 g、肉桂1.5 g, 共计16.5 g)。取红参75 g、黄芪225 g、炙甘草75 g、肉桂37.5 g，加10倍水浸泡过夜，沸腾后改文火煎煮1 h，倒出药液，第二次和第三次煎煮加8倍水，文火煎煮1 h，合并药液，过滤、浓缩至每1 mL药液含1 g生药的保元汤样品，冷却分装，4 ℃保存备用。

2.2 模型建立与给药

雄性KM小鼠48只，采用随机数字表法分为空白对照组(NC)、模型组(M)、阳性对照组(PC，2.0 g/kg)、保元汤低剂量组(BY-L，2.0 g/kg)、中剂量组(BY-M，6.0 g/kg)和高剂量组(BY-H，12.0 g/kg)，每组8只。适应性饲养3 d后，参照文献[19]方法，采用腹腔注射CTX(80 mg/kg，连续3 d，1次/ d)的方法建立小鼠血虚证模型，空白对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水。

给药组小鼠每天灌服对应药物，空白对照组与模型组给予等量生理盐水，灌胃量为0.1 mL/10 g，1次/d，从造模第一天起，连续给药14 d，试验期间自由饮水、摄食，每日记录小鼠体重。

2.3 样本采集与处理

末次给药30 min后，尾静脉采血20 μL进行血常规分析，摘眼球取全血。全血4 ℃静置2 h后，12 000 r/min 离心15 min，移取血清置-80 ℃保存待分析。取胸腺和脾脏进行称重, 分别计算胸腺及脾脏指数。100 μL血清样本室温解融后，加入1 200 μL甲醇，充分涡旋30 s，超声10 min，12 000 r/min离心15 min，取上清液200 μL至2 mL玻璃瓶中，氮气吹干，加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，涡旋混匀，置70 ℃水浴锅中加热。1 h后取出，待冷却至室温，加入BSTFA+TMCS(99∶1)50 μL，涡旋30 s，再次于70 ℃水浴锅中加热1 h。冷却后加入正庚烷100 μL，涡旋混匀，0.22 μm滤膜过滤，滤液置进样瓶中待分析。

2.4 GC-MS分析参数

Rtx-5MS毛细管柱(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)进样口温度：280 ℃，分流比为10∶1，载气：He(99.999%)，流速：1.0 mL/min；程序升温：初始温度80 ℃，保持5 min，然后以4 ℃/min的速度升温至300 ℃，保持10 min；进样量：1 μL。电子轰击离子源温度：230 ℃，轰击能量：70 eV，倍增电压：1.0 kV；四级杆温度150 ℃；质谱扫描离子范围：50～1 000m/z；溶剂切除时间：4 min。

2.5 数据处理

将GC-MS谱图数据以“. cdf”格式输出，在XCMS online数据平台进行峰识别与对齐，谱图滤噪，基线校正，保留时间校正等处理，获取的数据矩阵导入SIMCA 14.1软件，结合总离子流图(total ionchromatograms, TIC)中峰信息，以主成分分析(principal components analysis, PCA)对变量进行降维并将其聚类，绘制主成分分类图，采用偏最小二乘法-判别分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)筛选变量投影重要度(variable important projection, VIP)>1.0的变量为可能的差异性代谢标志物。

2.6 差异性代谢物鉴定

结合质荷比(m/z)与色谱保留时间(RT)等参数，对比NIST17质谱数据库、KEGG(https: //www. genome. jp/kegg/)、HMDB(https: //hmdb. ca/)和SMPDB(http://www.smpdb.ca/)等在线数据库对可能的差异性代谢物进行确认，利用MetaboAnalyst 5.0(https: //www. metaboanalyst. ca)网站对鉴定出的差异代谢物进行代谢通路分析。

3 结果与分析

3.1 一般行为学观察

空白组小鼠行动敏捷，被毛有光泽，眼睛转动灵活，鼻唇洁净、湿润，呈淡粉红色。模型组小鼠均出现精神萎靡、行动迟缓，口唇颜色苍白，饮水量增多，进食减少等症状。相比模型组，保元汤组小鼠相关症状有所缓解。

3.2 保元汤对小鼠体重的影响

分别计算各组小鼠体重变化率r，公式为

r=(W2-W1)/W1×100%

(1)

式(1)中：W2为实测体重；W1为起始体重。

如图1所示，除空白组外，接受CTX注射的各组小鼠体重明显呈下降趋势，造模结束后随给药天数增加体重逐渐恢复上升趋势，但始终低于空白组。其中保元汤中剂量组和阳性对照组与空白组最为接近。

图1 小鼠体重14 d变化趋势Fig.1 Body weight growth rate of mice during 14 days

3.3 血常规分析及脏器指数

如表1所示，模型组小鼠外周血中白细胞(WBC)数量与空白组相比显著下降(P< 0.01)，单核细胞比例也明显降低(P< 0.05)，中性粒细胞比例显著上升(P< 0.01)，与模型组相比，各给药组小鼠外周血白细胞数量与单核细胞比例均有不同程度的升高。如图2所示，与空白组相比，模型组小鼠胸腺和脾脏均出现代偿性增大，表明注射CTX对小鼠免疫器官产生了影响，对应的胸腺及脾脏指数明显增加(P< 0.001，P< 0.05)，小鼠血虚证模型建立。阳性对照组、保元汤中剂量组和保元汤高剂量组胸腺及脾脏指数有所降低，其中以保元汤中、高剂量组较为明显。以上结果提示保元汤可提高CTX造成的免疫抑制小鼠白细胞数目、单核细胞比例和中性粒细胞比例，缓解CTX所致的免疫器官受损。

表1 各组小鼠血常规指标对比

与NC组对比，*P<0.05, **P<0.01；与M组对比，#P<0.05, ##P<0.01；数据以平均值±标准差表示，每组小鼠样品数量n=8图2 各组小鼠脏器指数对比Fig.2 Comparison of spleen and thymus index

自上而下依次为空白组、模型组、阳性对照组和保元汤中剂量组图3 各组血清样品典型总离子流图Fig.3 Typical total ion chromatograms of serum samples in different treated groups

3.4 差异性代谢物的筛选

图4 多元统计分析结果Fig.4 Multivariate statistical analysis results

3.5 基于代谢组学分析保元汤对CTX诱导的血虚证小鼠的影响

为进一步评价保元汤对环磷酰胺所致免疫抑制型血虚证小鼠的治疗作用，将归一化处理后的各组GC-MS血清数据输入MetaboAnalyst 5.0进行多元统计分析。如图5所示，PLS-DA得分图显示各给药组与模型组区分良好且远离模型组，接近空白组，表明各给药组对血虚证模型均具有一定的干预效果。其中保元汤中剂量组相比其他剂量给药组更接近空白组且远离模型组，结合血常规和脏器指数，表明保元汤中剂量组干预CTX所致血虚证效果较好，因此下一步以3.4节部分筛选出的差异性代谢物为指标，观察保元汤中剂量各代谢物水平的变化，结果显示，给予保元汤可以显著上调机体内甘油、肌醇、硬脂醇、亚油酸、油酸水平，下调乳酸、草酸、2-酮丁酸、棕榈酸、硬脂酸水平。

1为空白组；2为模型组；3为阳性对照组；4为保元汤低剂量组；5为保元汤中剂量组；6为保元汤高剂量组图5 PLS-DA分析结果Fig.5 PLS-DA loading plot of different treated group

3.6 代谢通路分析

利用MetaboAnalyst 5.0对表2中的10个潜在差异性代谢物进行代谢通路的富集分析，得到14条代谢通路，通路分析影响值如图6所示。以影响值(impact)>0.1为判定标准，其中3条受到较大扰动，如表3所示。综合上述研究结果并对相关文献进行分析，推测保元汤干预小鼠血虚证模型较为密切的3条代谢通路为亚油酸代谢、甘油酯类代谢和磷酸肌醇代谢。

a为亚油酸代谢；b为甘油酯类代谢；c为磷酸肌醇代谢图6 代谢分析影响值Fig.6 Metabolic analysis impact value

表3 血虚证小鼠受扰动的代谢通路

4 讨论与结论

采用腹腔注射CTX复制以白细胞减少为标志的小鼠血虚证模型，考察了低、中、高3个剂量的保元汤对血虚证小鼠的治疗作用，并以免疫细胞数、免疫器官脏器指数等指标初步评价保元汤的药效。胸腺和脾脏是机体主要的两个免疫器官，其脏器指数能反映机体免疫功能[20]。保元汤可使血虚小鼠脏器指数下降，缓解CTX所致的胸腺及脾脏受损。保元汤中、高剂量组小鼠血清中白细胞数、单核细胞数等显著回升，表明保元汤可改善CTX诱导的血虚证，恢复机体免疫功能。

表2 潜在差异性代谢标志物及其相对峰强度变化

代谢组学研究结果显示，血虚证小鼠体内受较大扰动的代谢通路有亚油酸代谢、甘油酯代谢和磷酸肌醇代谢，涉及的差异性代谢物为亚油酸、甘油和肌醇。与正常组相比，模型组中乳酸、草酸、2-酮丁酸、棕榈酸、硬脂酸的含量显著升高，乳酸、草酸、2-酮丁酸、棕榈酸、硬脂酸的含量显著下降，上述10个化合物可能是与血虚证相关的潜在差异性代谢物。

亚油酸是一种不饱和脂肪酸，是生长发育的必需脂肪酸，参与构建细胞膜，对细胞信号传导、基因表达调节等有着重要的影响，有助于降低血清胆固醇和抑制动脉血栓的形成，作用机制与花生四烯酸类似[21]，其含量降低可能与造血干细胞的坏死和凋亡有一定的关系[22-23]。GC-MS血清代谢组学研究发现，模型组小鼠血清中亚油酸和油酸含量下降。保元汤给药组通过上调亚油酸减轻氧化应激反应，缓解血虚症状。

甘油酯是甘油和脂肪酸经酯化所生成的酯，在机体内负责贮存能量与输送。甘油作为重要小分子物质，是甘油三酯的前体，参与多条代谢通路如甘油酯类代谢、甘油磷脂类代谢等。代谢组学结果表明，模型组小鼠血清中甘油含量显著下降，游离脂肪酸如硬脂酸、棕榈酸等含量上升，推测血虚证可能干扰机体甘油酯类合成，保元汤给药组对应物质含量恢复正常水平。

肌醇可降低胆固醇含量，并参与磷酸肌醇代谢，生成肌醇三磷酸和二酰基甘油，后者通过升高细胞内钙和激活蛋白激酶而发生一系列生理生化反应[24]。作为许多二级信使的前体分子，肌醇由葡萄糖合成，是磷脂酰肌醇的组成部分，广泛分布在动植物和微生物体内。肌醇代谢的稳定对于维持机体正常生理功能至关重要。模型组小鼠的肌醇显著下降，保元汤可提高血虚模型小鼠的肌醇含量趋于正常。

综上，首次从代谢组学角度探讨了中药复方保元汤对血虚证的影响并对相关的代谢通路进行了分析，一定程度上可反映血虚证小鼠代谢水平的变化。鉴定出的差异性代谢物以脂肪酸类物质为主，发现保元汤对血虚证小鼠体内3条紊乱的代谢通路均有较好的调节作用。中医理论认为，气能生血、行血，血能养气、载气，两者互为阴阳，故气虚一般均会导致血虚。CTX可使脾气亏虚，无力生化血液，进而表现出血虚的一系列症状。保元汤善补元气，补气的同时亦能补血。采用中医证候动物模型与代谢组学相结合的研究方法，借助生化指标评价其药效，有助于系统了解机体的病理生理过程，较好地契合了中医学“整体观念，辨证论治”的理论。并为进一步研究中医“血虚证”的本质提供参考和借鉴。