罗莹，黄智，李亚兰，廖明

(广西医科大学，广西 南宁 530021)

0 引言

广西地处亚热带，气候与自然环境都非常适合蛇类生存，毒蛇的种类繁多。近年来，随着城市绿化生态的还原以及人工养蛇业和食蛇餐饮业的发展，广西的蛇伤病例居高不下，每年约有3～4万人被蛇咬伤[1]。仅据本校附属医院急诊科统计2006-2015年十年的数据显示，平均每年收治的蛇伤患者近100例[2]。可见，广西长期以来是蛇伤的重点区域，蛇伤的临床诊断和治疗已成为广西医疗卫生行业的突出问题。

眼镜蛇咬伤是我国南方最常见的蛇伤之一，位居毒蛇咬伤发病率的第二位[3]，而在广西则位于毒蛇咬伤的首位[4]。眼镜蛇的蛇毒为混合毒且组成成分十分复杂，造成眼镜蛇咬伤后的病理生理具有多样性，临床特征往往体现为伤口肿胀、溃烂坏死，呼吸困难、心力衰竭等等，严重者出现休克甚至死亡。目前，由于缺乏对广西眼镜蛇蛇毒所有成分的了解，给治疗带来了不少的困难，因此有必要详细对广西眼镜蛇蛇毒的蛋白质组进行研究，旨在为广西眼镜蛇的蛇伤诊治提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

CCK-8试剂盒购于中国MCE。甲酸、乙腈购 于 德 国Merck公 司；DTT、IAA buffer、Trypsin buffer、 NH4HCO3均购于美国Sigma公司。广西眼镜蛇蛇毒冻干粉从广西医科大学蛇毒研究所获得。AB Triple TOF 5600/6600质 谱 仪（美 国AB SCIEX公司）；1290 Infinity LC超高压液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）。

1.2 蛇毒的定量和SDS-PAGE检测

取蛇毒冻干粉适量，溶解于高纯水，CCK-8试剂盒测蛇毒蛋白质的含量。12% SDS-PAGE对蛇毒蛋白质的质量进行分析。

1.3 蛇毒的FASP酶解

取蛇毒冻干粉适量，溶解于高纯水。然后取30µl溶解好的蛇毒溶液，加DTT达浓度为100mM，100℃5min，室温下冷却。接着加入200µLUA缓冲液混匀，经30kD超膜过滤，15min离心（14000g），弃滤液(重复以上步骤1次)。加入100µLIAA缓冲液，1min振荡（600rpm），室温下 反 应30min（避 光），14000g离 心15min。加入100µLUAbuffer离心14000g15min，重复2次。加 入100µL25mMNH4HCO3溶 液，14000g离 心15min，重复该步骤两次。加入40µLTrypsin缓冲液，振荡1min（600rpm），37℃放置16-18h，14000g离心15min，收集滤液。肽段用C18Cartridge脱盐，然后冻干，接着40µL0.1%CH2O2复溶，OD280进行定量。

1.4 LC-MS质谱分析

取1 µl酶解后产物进行LC-MS/MS分析（纳升级系统Easy nLC,）每个样品进样一次。采分离过程：A 液：0.1%甲酸,B 液：0.1%甲酸乙腈 (乙腈为84%)。95% A 液平衡色谱柱。样品上样到色谱柱Thermo scientific EASY column分离,流速：300 nL/min。相关设置: 2小时梯度: 0 min- 110 min, B液从0%-55%;110 min- 115 min, B液从55%-100%;115 min- 120 min, B液维持在100%。质谱仪质谱分析条件:正离子; 300-1800 m/z母离子扫描;一级质谱70,000 at m/z 200 分辨率；每次全扫描后采集20个碎片图谱进行二级质谱分析（分辨率:17,500 at m/z 200）。

1.5 质谱数据分析

原始文件(raw file)采用分析软件PD-Mascot查库进行数据库检索。蛋白数据库为uniprot_Naja_981_20201030.fasta。(http://www.uniprot.org)。其中搜库参数设定: Enzyme为Trypsin；Missed cleavage sites 设为2；固定修饰为Carbamidomethyl (C)；动态修饰设定Oxidation (M)；过滤参数为FDR≤0.01。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE分析结果

考染结果见图1，蛇毒样品条带分离清晰，质量满足质谱鉴定的实验要求。

图1 广西眼镜蛇蛇毒SDS-PAGE电泳考染分析图

2.2 LC-MS/MS鉴定广西眼镜蛇蛇毒蛋白质结果

质谱共鉴定到了59个蛋白，包括19大类的蛋白质：酸性磷脂酶A2，蛇毒神经生长因子，细胞毒素，神经毒素，金属蛋白酶，蛇毒磷酸二酯酶，磷脂酶A2受体抑制蛋白，富含半胱氨酸蛇毒蛋白，蛇毒5核苷酸酶，氨基酸氧化酶，Thaicobrin蛋白，磷脂酶A2，Nakoroxin蛋白，蛇毒抗菌肽，补体因子，丝氨酸蛋白酶抑制子，SH3结构域结合蛋白4，E3泛素蛋白连接酶，Envoplakin蛋白等。详细见表1。质谱分析的蛇毒蛋白质Basepeak图谱见图2。

图2 蛋白质Basepeak图谱

表1 LC-MS/MS鉴定广西眼镜蛇蛇毒蛋白列表

续表1

3 讨论

广西属于全国毒蛇咬伤高发区，每年的致死率和伤残率居高不下，成为突出的公共卫生问题。相关资料显示，广西常见毒蛇咬伤中，六成以上是眼镜蛇伤。蛇毒的生理和病理活性主要与其含有的蛋白质或肽段有关，因蛋白质组学技术在复杂体系中检测低丰度蛋白质的方面具备优势[5-7]，可以通过蛋白质组学技术全面分析蛇毒的蛋白组成。最近几年相继有学者对中国境内的蝮蛇、蛇岛蝮、莽山洛铁头蛇等蛇毒[8-10]蛇毒蛋白组学研究。在中华眼镜蛇蛇毒中蛋白质组的研究中，Shan（2017）等人采用质谱技术鉴定到5类蛋白质家族共32个蛋白质[11]，张经硕（2019）等人从筛选到11类蛋白质家族共17个蛋白质[12]。目前，由于缺乏对广西眼镜蛇蛇毒具体蛋白质成分的了解，本研究采用液质联用的串联质谱LC-MS/MS对广西眼镜蛇蛇毒的蛋白质组进行研究，质谱共鉴定出19类的蛋白质家族，共59个蛋白；分析发现细胞毒素类家族蛋白占了13个，为最多；接着是神经毒素家族类为10个和酸性磷酸酶家族类为6个。本实验获得的广西眼镜蛇蛇毒蛋白质的组成，将为蛇毒蛋白纯度的检测、表征和应用提供了可靠依据，可为蛇毒蛋白组分的纯化、药效、结构与功能等研究提供重要的信息，也同时为广西眼镜蛇的蛇伤诊治提供基础数据。