李嘉宇，杨玉蓉，朱栋才，李 杰，杨志龙，杨 涛，*

（1.中南林业科技大学 食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.江西李渡酒业有限公司，江西 南昌 331725；3.湖南湘窖酒业有限公司，湖南 邵阳 422006）

特香型白酒主体香为清香带浓香，细闻有焦糊香，浓、清、酱香型白酒特征兼而有之，但又不接近哪一种香型。“曲为酒之骨”，酒曲作为酿酒生产中的一种糖化剂、发酵剂与生香剂，在发酵过程中起着至关重要的作用，故有“有美酒必备佳曲”之说[1]。在酿酒生产过程中，酒曲在提高出酒率、降低粮耗、增加优质品率、保持香型稳定等方面有着重要的作用[2]。不同类型的酒曲能生产不同类型的酒。酒曲微生物是发酵产酒的本质原因，所以只要了解酒曲中微生物的习性与作用，就能够对改善酒曲品质以及出酒的质量起到指导生产的作用。

国内有关酒曲的相关研究较多，但有关特香型酒曲霉菌控制则相对少见。刘效毅等[3]通过分子生物学对高温大曲中的微生物进行序列分析，鉴定得到大曲中细菌主要是芽孢杆菌、放线菌、葡萄球菌、微球菌；霉菌主要是青霉、曲霉、毛霉、交链孢霉、茎点霉菌、球毛壳、散囊菌、红曲霉。酒曲中霉菌的生长伴随着大曲生产的整个环节，特香型大曲中霉菌类群占一定比例，数量能达到104CFU/g，主要是毛霉、青霉和曲霉[4-5]。霉菌能够产生分解淀粉和蛋白质的酶，不同种类的霉菌能够产生不同种类的酶，在不同的发酵条件下产生的酶种类与作用都不尽相同，其主要功能是分泌糖化酶、液化酶及蛋白酶，对分解酿酒原料中的淀粉、蛋白质等大分子物质具有积极的推动作用，使得整个反应体系中糖类及氨基酸含量升高，可为其他微生物的代谢提供基础物质，亦为后续的酒体风味形成奠定基础[6-8]。霉菌的主要来源为空气、场地、原辅料、母曲及人体[9]。随着白酒工艺的日渐发展，消费群体层次的改变，白酒行业也在不断进行着改革创新，人们对白酒的品质要求也日渐提高。特香型酒曲的贮藏期在3～6个月不等[10]，如何保证酒曲在贮藏期的品质质量现已成为了各个酒厂的关键问题。酒曲在贮藏期最常见的质量问题就是长霉，适量的霉菌在酒曲中有加强风味、提高酒曲质量的作用[11]。但是霉菌过多则会使得酒曲出现霉变结块、有杂质、风味不纯等问题。如若使用了这些霉变酒曲酿酒会使酒体带有邪杂味，色泽与醇厚感也会大打折扣，还对人体健康有很大的威胁[12]。

本研究以江西某企业提供的不同质量特香型酒曲为原料，测定了霉菌二次生长大曲的理化指标，并对毛霉的理化性质、对酵母产酒精能力的影响进行分析，为后续特香型大曲的防霉抑霉工作提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验样品

同一批次霉菌二次生长曲样（霉心曲块、霉曲整块）与正常曲样（好曲整块）若干：江西某特香型酒企提供；米根霉（Rhizopus oryzae）1号、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：保存于中南林业科技大学食品科学与工程学院。

1.1.2 化学试剂

葡萄糖、氢氧化钠、盐酸、可溶性淀粉、碘、碘化钾、DL5 000 Marker（均为分析纯或生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 培养基

A：马铃薯葡萄糖培养基（potato dextrose agar，PDA）：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，17 g琼脂，1 000 mL蒸馏水。115 ℃灭菌20 min。

B：PDA+大曲浸出汁（10%）：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，17 g琼脂，900 mL蒸馏水，100 mL大曲浸出汁。

大曲浸出汁液（10%）：将100 g正常曲样捣碎，加900 mL水，振荡1 h，过滤，弃去滤渣，收集大曲浸出汁。115 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

AC2-2E8超净工作台：新加坡艺思高科技有限公司；YXQ-50A立式高压灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；MIR-150A恒温培养箱：上海三腾仪器有限公司；YCW-160B摇床：上海捷呈实验仪器有限公司；3730XL测序仪、2720 thermal cycler聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国Applied Biosystems公司；Legend Micro17离心机：Thermo公司；JY300C电泳仪、JYDF电泳槽、JY04S-3C凝胶成像仪：北京君意东方电泳设备有限公司；DFD-700水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酒曲样品菌群分析方法

内部转录间隔区核糖体脱氧核糖核酸（internal transcribed spacer ribosomal deoxyribonucleic acid，ITS rDNA）扩增子测序，是通过特异性引物扩增样本中原核生物ITSrDNA的可变区，构建高通量测序文库并对ITS rDNA可变区序列进行分析，从而鉴定环境中原核微生物的组成与丰度的方法。ITS rDNA扩增子测序的实验流程包括样本基因组DNA的提取与质检、ITS rDNA可变区扩增与测序文库构建、高通量测序等多个步骤，该部分操作委托苏州金唯智公司进行测试，将所有优化后的序列与物种操作单元（operational taxonomic units，OTU）代表序列进行比对，与OTU代表序列相似性在97%以上的序列为同一OTU，统计生成OTU丰度表。

1.3.2 特香型大曲理化指标的测定

水分测定：使用差重法，将大曲试样置于101 ℃条件下烘干3 h并取出冷却称质量，重复试验直至质量恒定（精确至0.001 g）[13]。

糖化力测定：使用滴定法，参考QB/T4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[14]。空白对照记录其消耗葡萄糖体积为V1，正式实验记录其消耗葡萄糖体积V2，糖化力按下式计算：

式中：X1为糖化力，mg/（g·h）；V1、V2是消耗葡萄糖溶液体积，mL。

淀粉含量测定：参考QB/T4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》。

液化力测定：制备5%酶液，使用比色法测定液化力，参考QB/T4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》，记录下反应时间t。液化力以下式计算：

式中：X2为液化力，g/（g·h）；V是酶液定容体积，mL。

酸度测定：取大曲试样10 g，加无菌水200 mL，常温振荡30 min，收集滤液。吸取样液20 mL加无菌水30 mL，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定至pH为8.2，记录氢氧化钠溶液体积V1，同时做空白实验，记录体积V0，酸度以下式计算[15]：

式中：X3为酸度，mmol/10 g；c为氢氧化钠溶液浓度，mol/L；V1、V0是消耗氢氧化钠溶液体积，mL。

1.3.3 霉菌的分离鉴定

取霉菌二次生长明显的大曲，将发霉部分（约10 g）取下，加入90 mL无菌水，放入锥形瓶中振荡1 h，将其孢子完全振荡至悬液中。以涂布的方式将上述孢子悬液涂布至A、B两种培养基中，30 ℃备用。使用DNA提取试剂盒提取DNA，进行PCR扩增、凝胶电泳。ITS rDNA扩增子的引物对为ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。菌种鉴定序列与美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库进行比对。ITS扩增体系为：1×PCR mix 45 μL、ITS1（10P）2 μL、ITS4（10P）2 μL、DNA模板1 μL。PCR扩增程序见表1。

表1 聚合酶链反应扩增程序Table 1 PCR amplification procedure

1.3.4 伞状毛霉对酵母产酒精能力的影响

酵母产酒精能力的测定参照王犁烨等[16]的方法，将菌液浓度均为106CFU/mL的霉菌孢子悬液与酿酒酵母菌悬液以不同比例混合，以5%的接种量分别装于有杜氏小管以及15 mL的PDA液体培养基的试管中，要确保杜氏小管内无气泡，30 ℃摇床培养。每隔12 h观察一次产气情况并记录杜氏小管内的气体体积[17]。

1.3.5 pH适应性

配制PDA培养基后灭菌，在超净台中使用1 mol/LNaOH溶液或1 mol/L HCl溶液调整其pH值分别为5、6、7、8、9、10、11、12。将霉菌二次生长曲样在30 ℃自然湿度条件下培养3 d，每隔12 h测其菌落直径[18-19]。

1.3.6 温度适应性

将接种霉菌的平板分别于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，自然湿度条件下培养3 d，每隔12 h测其菌落直径[20]。

1.3.7 湿度适应性

将霉菌接种的平板分别于湿度70%、75%、80%、85%、90%、95%，30 ℃条件下培养3 d，每隔12 h测其菌落直径[21]。

1.3.8 数据处理

运用Excel 2019进行数据收集处理，Origin 9.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 OTU聚类分析

由表2可知，霉菌二次生长酒曲的OTU6毛霉为主要的二次生长霉菌，其数量显著高于优质酒曲5～10倍。而在根霉OTU数量上，好曲要多于霉菌二次生长的酒曲。

表2 酒曲样品OTU聚类分析Table 2 OTU cluster analysis of Jiuqu sample

2.2 特香型大曲理化指标测定

2.2.1 水分含量测定

大曲贮存的时间越长，成曲中的水分含量就越低，表明发酵产生的游离水分越多、挥发程度越好，大曲发酵的成熟度就越好。由图1可知，霉心曲块、好曲整块、霉曲整块的水分含量依次为14.5%、12.5%、11.7%。霉心曲块水分含量最高，所以霉菌生长的最好；而霉曲整块的水分含量比好曲整块要低，分析原因是因为霉心处水分含量比整体高，能促进真菌细菌的生长繁殖，而微生物的大量繁殖会产生热量，会导致周围的曲块水分蒸发[22-23]。

图1 酒曲水分含量比较Fig.1 Comparison of moisture contents of Jiuqu

2.2.2 糖化力测定

糖化力是衡量酒曲糖化作用强弱最重要的指标，指的是酒曲中具有糖化作用的酶及微生物将淀粉转化为糖的能力，酒曲糖化力的高低受到很多因素（如温度、湿度、微生物生长情况等）的影响，是酒曲最为重要的理化指标之一。由图2可知，好曲整块、霉曲整块、霉心曲块的糖化力依次为818.6 mg/（g·h）、669.8 mg/（g·h）、622.8 mg/（g·h）。毛霉的糖化力本就比根霉要低很多，分析原因是因为酒曲中毛霉的二次生长影响了根霉的糖化作用。糖化力下降导致大曲糖化能力不足，淀粉转化为糖的能力下降，曲中糖分减少[24]。

图2 酒曲糖化力比较Fig.2 Comparison of saccharification power of Jiuqu

2.2.3 淀粉含量测定

由图3可知，霉心曲块、霉曲整块、好曲整块的淀粉含量依次为34.84 g/100 g、35.66 g/100 g、37.59 g/100 g，好曲整块的淀粉含量最高。淀粉含量不足会导致转化成糖分的含量降低，进一步导致酒精产量不足[25]。

图3 酒曲淀粉含量比较Fig.3 Comparison of starch contents of Jiuqu

2.2.4 液化力测定

液化酶能够水解淀粉，产生糊精、低聚糖和单糖，并为后续的发酵过程提供底物。由图4可知，霉心曲块、霉曲整块、好曲整块的液化力依次为0.168 g（/g·h）、0.216 g（/g·h）、0.259 g（/g·h）。液化力降低会使得酵母产酒精能力下降，无法将糖转化为乙醇，使得酒精度不足，口感下降[26]。

图4 酒曲液化力比较Fig.4 Comparison of liquefaction power of Jiuqu

2.2.5 酸度测定

酒曲的酸度大小可以反映出大曲复合曲香物质的强弱程度。由图5可知，霉心曲块、霉曲整块、好曲整块的酸度依次为0.65 mmol/L、1.12 mmol/L、1.54 mmol/L。其中霉心处的酸度低于特香型大曲酸度的最低值（0.8 mmol/10 g）。有可能是二次生长的霉菌抑制了产酸微生物的产酸代谢，导致其活性下降，产酸性能也随之下降。

图5 酒曲酸度比较Fig.5 Comparison of acidity of Jiuqu

2.3 分离霉菌的菌落形态及分子生物学鉴定

由图6可知，通过微生物菌落形态观察，菌落絮状，初为白色或灰白色，后变为灰褐色，菌丝密集且成絮状，顶端有黑色小点；显微镜下菌丝极少分隔，有分枝，无假根及匍匐菌丝。孢子囊较大、球形、顶生内含孢子量多。孢子囊孢子球形、椭圆形。孢囊梗单生、不成束，单轴分枝或假单轴样分枝，初步判断该菌为毛霉菌。由表3可知，菌株A3和A4与伞状毛霉（Lichtheimia corymbifera）（BMU07174）同源性达100%，亲缘关系最近，结合形态观察，鉴定该毛霉为伞状毛霉（Lichtheimia corymbifera）。

图6 分离霉菌菌株的菌落形态Fig.6 Colony morphology of isolated mould strains

表3 菌株的同源性比对结果Table 3 Comparison results of homology of strains

2.4 伞状毛霉对酵母产酒精能力影响

因为酵母在发酵过程中产生CO2和酒精，所以产CO2的量与发酵产乙醇的量具有对应关系，以此判断酵母产酒精的能力[27-28]。由表4可知，空白实验和全毛霉发酵的实验中，培养基中没有产生气体。而全酵母实验中产气量为最多，达到了5 cm。在混菌发酵中，随着伞状毛霉比例的增加，产气量下降，说明产酒精能力下降；但达到1∶1的接种量比之后，随伞状毛霉比例的增加，产气量维持一定。

表4 酿酒酵母与伞状毛霉比例对酵母产酒精能力的影响Table 4 Effect of Saccharomyces cerevisiae and Mucor umbellifera ratio on alcohol production of yeast

2.5 伞状毛霉的生长特性

2.5.1 pH适应性

由图7可知，pH值为7的时候霉菌的菌落直径最大，pH越高霉菌的菌落直径越小。在pH为12时，霉菌的生长环境最差，生长速率也最慢。pH的适应从强到弱依次为pH7＞pH9＞pH8＞pH6＞pH5＞pH10＞pH11＞pH12。虽然pH对毛霉菌落直径有一定影响，但整体趋势未发生太大变化，pH的适应范围较大。说明pH值对霉菌生长的影响在一定范围内十分有限，所以只需将pH值控制在5～11之间即可。

图7 不同pH对伞状毛霉生长的影响Fig.7 Effect of pH on the growth of Mucor umbellifera

2.5.2 温度适应性

由图8可知，霉菌在35 ℃时的与菌落直径最大，低于35 ℃或高于40 ℃的生长速率与菌落直径均有下降趋势，其最佳生长温度为35～40 ℃。温度的适应性从强到弱依次为35 ℃＞40 ℃＞30 ℃＞45 ℃＞25 ℃。说明霉菌生长对温度的要求是比较高的，而且对其生长的影响较大，温度适应性的分界线也比较明显。

图8 不同温度条件对伞状毛霉生长的影响Fig.8 Effect of different temperature on the growth of Mucor umbellifera

2.5.3 湿度适应性

由图9可知，相对湿度在80%时霉菌的菌落直径与生长速率最大。在相对湿度低于70%或高于85%时，霉菌的生长受显著抑制。相对湿度适应性从强到弱依次为80%＞75%＞70%＞90%＞85%＞95%。湿度适应性的分界线也比较明显，且对毛霉有较大的的生长影响。

图9 不同相对湿度对伞状毛霉生长的影响Fig.9 Effects of different relative humidity on the growth of Mucor umbellifera

3 结论

通过比较不同质量大曲理化指标得知，如果一块大曲的伞状毛霉菌出现了二次生长的情况，其糖化力、液化力等重要的酿酒指标均会降低。而这些指标都是环环相扣的，淀粉通过糖化作用转化为糖分，又通过液化作用产生酒精，每一个环节的能力都弱一些，最后出酒的风味就会大打折扣，使酒的糖度、酒精度、风味都远低于标准。

通过对储藏期二次生长霉菌的鉴定，得出特香型大曲储藏期二次生长的霉菌为伞状毛霉。伞状毛霉的生长环境在pH5～10时差距并不明显，储藏期大曲的平均水分含量要控制在12.5%，储藏温度控制在25 ℃，环境相对湿度不要超过70%为最佳条件。