周 娟，龙云川，周 伟，邓春英，黄 霞，周少奇

(1.贵州科学院，贵州 贵阳 550001；2.贵州大学 资源与环境工程学院，贵州 贵阳 550025；3.清华大学 环境学院，北京 100084)

自然界中的微生物资源丰富且广泛分布于各种生境中，微生物资源能为农业、工业、医药、食品等行业提供所需的材料和能源。放线菌是微生物资源中不可或缺的一大类，在土壤生物地球化学循环和土壤生态系统中具有重要作用。放线菌实际的应用价值和经济价值都极其广泛，在自然环境中能产生很多有活性的物质，如抗生素、酶及其抑制剂等。此外，放线菌能生产具有临床和药学重要性的新型先导化合物，在目前已知的1000种不同抗生素中，约70%是由放线菌生产的。近年来，更多新的活性物质从特殊生境微生物中分离纯化出来，而作为活性物质新来源的放线菌受到了国际科学研究者的关注和重视。

贵州喀斯特地区复杂的地形、裂隙悬崖、溶洞和多变的气候条件形成了多种生态系统，促进了生物多样性的丰富程度。由于区域的自然条件和地理隔离具有一定的特殊性，不同生境条件下微生物的多样性组成在一定程度上存在明显差异。目前关于贵州喀斯特地貌不同生境放线菌的资源及多样性研究相对较少，因此，本研究选取贵州西南喀斯特不同地区不同生境的土壤作为研究对象，对土壤中的放线菌进行分离、筛选、鉴定，通过分析考察不同生境中放线菌的分布和多样性，为贵州地区的微生物资源现状开发、保护和可持续利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

分别从贵州兴义万峰林国家地质公园(104°55′24″E，25°59′17″N)、六盘水梅花山(104°33′52″E，26°44′56″N)、毕节威宁草海国家自然保护区(104°14′39″E，26°51′59″N)、毕节金沙县(106°20′51″E，27°28′35″N)、遵义绥阳双河洞(107°20′30″E，28°10′42″N)采集土壤样品，采样区域具体信息如表1所示。

表1 研究区域基本信息Tab.1 The basic information of the study areas

.研究方法

..土壤样品的采集与制备

分别选取采样区域不同生境土壤作为样品来源，设置10 m×10 m样方，采用五点法采集样方内土壤，每个点采集3个不同样品充分混匀作为该点土样，采样时将所采区域范围的植被、落叶用取样器刮除，离地表面5～20 cm深处用取样器均匀取样，剔除石砾、植被残体等，将土壤样品充分混匀，取部分装进无菌自封袋带回实验室，及时冷冻干燥，研磨为均匀细小的颗粒，放于-20 ℃冰箱中标号保存以备用。

..放线菌的分离纯化

将处理后的土壤样品分别进行放线菌的分离纯化。采用十倍梯度稀释法制备土样，选取10、10、103个稀释浓度的土壤菌悬液，均匀涂布于改良后的高氏1号培养基平板上，为抑制土壤样品中其他微生物的生长繁殖，确保分离得到放线菌，本研究在灭菌后的高氏1号培养基中添加了75 mg/L的无菌重铬酸钾。经28 ℃培养7～15天后，观察各平板上菌落的长势和色素分泌情况，挑取不同的单菌落进行多次分离纯化，最后将纯化菌株进行斜面保藏和甘油保存。

..放线菌的形态鉴定

将分离得到的放线菌菌株进行形态鉴定，观察记录菌株在高氏1号培养基上的形态、可溶性色素颜色、气生和基内菌丝颜色、形状等，在光学显微镜下观察菌株菌丝体特征，参照《放线菌分类基础》、《链霉菌鉴定手册》将菌株鉴定到属或链霉菌的类群。

..放线菌的16S rDNA序列分析

利用细菌DNA抽提试剂盒提取纯培养放线菌的基因组，选用通用引物7F(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)扩增放线菌的16S rDNA基因片段。基因扩增反应体系参照龙云川等方法进行。PCR扩增产物经电泳验证后，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因序列测定与分析。运用MEGA软件通过Neighbor Joining方法构建放线菌各菌株系统发育树，并分析发育亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 典型放线菌菌株的形态特征

从贵州兴义万峰林国家地质公园、六盘水梅花山、毕节威宁草海国家自然保护区、毕节金沙县、遵义绥阳双河洞共采集土壤样品25份，用梯度稀释法分离纯化得到放线菌菌株156株，部分放线菌的典型菌落形态如图1所示。从图1可以看出，不同种类的放线菌菌株的孢子颜色、气丝颜色、基内丝体颜色存在一定差异，呈现白色、灰色、褐色、鲜黄色、橙红色等多种颜色，部分放线菌菌株还可产生不同颜色的可溶性色素。

注：a为菌株511(链霉菌属(Streptomyces)烬灰类群)；b为菌株531(链霉菌属(Streptomyces)灰褐类群)；c为菌株542(链霉菌属(Streptomyces)灰红紫类群);d为菌株552(链霉菌属(Streptomyces)灰褐类群)；e为菌株624(链霉菌属(Streptomyces)淡紫灰类群)；f为菌株1091(非链霉菌属)。图1 典型放线菌菌落Fig.1 Typical actinomycetes colonies

部分放线菌的菌丝形态如图2所示，图2-a孢子丝较直，少数呈螺旋形或环状，孢子呈柱形；图2-b孢子丝松敞，呈规则螺旋形，孢子呈椭圆形，表面较光滑；图2-c菌落致密，孢子丝呈紧密螺旋形，孢子多呈卵圆形，表面常有大突起。

注：a为菌株511；b为菌株552；c为菌株624。图2 放线菌菌丝的典型形态Fig.2 Typical morphology of actinomycetes mycelia

综上可知，不同种类的放线菌菌株的菌丝生长情况各异，有的菌株(图1-e)菌丝致密,有的菌株(图1-a)菌丝较为疏松。不同种类的放线菌孢子丝及孢子也形态各异(图2)。

2.2 典型放线菌菌株的鉴定

基于放线菌单菌落在平板中的培养特征，对相同放线菌菌株进行归类，挑选了25株代表性的菌株进行16S rRNA测序，得到放线菌菌株的分类学信息，如表2所示。分离得到的156株菌株分别鉴定为6个属：游动放线菌属()、小单孢菌属()、诺卡氏菌属()、类诺卡氏菌属()、放线菌属()、链霉菌属()，分别属于24个种和1个疑似新种。分离到18个不同种类的链霉菌属放线菌，7种稀有放线菌(非链霉菌属)。

表2 代表性放线菌菌株分类Tab.2 Taxonomic assignment of actinomycetes strains

2.3 不同生境对放线菌分布的影响

从各采集区域选择1种代表性的生境土壤样品进行生境对土壤放线菌分布的影响探究。不同生境中放线菌的分布如表3所示，采集地生境为荒地、山坡时，分离纯化出的放线菌菌株数量和放线菌所属的种类较少，采集地生境为湿地时，分离纯化出的放线菌数量和种类最多，喀斯特洞穴中(绥阳双河洞)次之。

表3 不同生境中放线菌的分布情况

2.4 放线菌的16S rDNA序列分析

在鉴定分离得到的放线菌菌株时，发现1个疑似新种(菌株L6152)，16S rDNA序列测定结果表明该基因片段大小为1463 bp。Blast分析结果显示，该菌株的序列与枝链霉菌()相似度为97.5%。构建的系统发育树(图3)显示，菌株L6152与枝链霉菌(该菌株登陆号为KX462528)虽位于同一分支，但亲缘关系较远，故该菌株为疑似新种，暂命名枝链霉菌(sp.nov.)。菌株L6152从喀斯特洞穴绥阳双河洞分离得到，该洞穴的特殊环境给新型放线菌的生存提供了有利条件。

图3 基于16S rDNA序列分析构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA

3 结论与讨论

以贵州喀斯特地区不同生境的土壤为对象，开展放线菌微生物资源及其多样性调查。在贵州兴义市、六盘水市、威宁县、金沙县、绥阳县等地采集土样标本25份，共分离得到不同种类的放线菌菌株156株，分属6个属及25个种，其中有1个疑似新种，暂命名枝链霉菌(sp.nov.)。放线菌群落中链霉菌属是占绝对优势的类群，广泛分布于5个不同生境的土壤中。链霉菌因代谢物丰富多样，具有很强的适应性；Long和D’Angeli的研究也证实了链霉菌属在多种生境的土壤中具有较高的丰度，本研究与其研究结果基本一致。

本研究结果表明，在进行放线菌菌株分离及资源利用时，应结合不同种类放线菌的生长特性及采样地生境特点。建议优先选择自然保护区和受人为活动干扰较少的区域，这有利于增加土壤放线菌的种类、数量以及发现稀有放线菌的概率。此外，本研究中稀有放线菌的种类和数量较少，这可能与采用的分离培养基种类较少有关。部分稀有放线菌有着独特的适应环境与培养条件，例如某些放线菌偏好寡营养的培养环境。

洞穴生境由于有机营养物质有限、无光照、湿度高等特点，是一类极端的生物栖息地。放线菌是细菌域中重要的门之一，在森林、农田等多种生境环境中都有发现。放线菌自身的代谢特点可以较好的适应洞穴生境的寡营养环境。本研究中发现洞穴生境中放线菌的分布较为丰富(绥阳双河洞)，与该研究结果一致。

稀有放线菌在培养基中的恢复及生长过程需要各种类型的特殊环境条件，本研究所分离出的稀有放线菌的种类和数量较少。后续放线菌菌株分离及资源采集时，可针对放线菌的生长特性及采样地生境特点，对分离培养基及分离条件进行针对性设计。本研究初步揭示了贵州喀斯特地区土壤微生物放线菌的分布，可为喀斯特区域放线菌的资源保护和开发利用提供科学数据。