杜春雷

（张家口市农产品质量安全监督检验中心，河北张家口 075000）

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

环丙沙星标准物质 [（100±0.10） µg/mL]：农业部环境保护科研监测所；液相色谱-质谱联用仪：G6470，安捷伦；分析天平：LE2002E，梅特勒；移液器：5 ～ 50 µL、100 ～ 1 000 µL，Thermo。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

（1）环丙沙星中间液配制。用移液器移取1 mL环丙沙星至10 mL容量瓶，乙腈定容，浓度为10 µg/mL。

（2）环丙沙星工作液配制。用移液器移取1 mL标准中间液至10 mL容量瓶，乙腈定容，浓度为1 000 ng/mL。

（3）基质标准工作曲线。用移液器分别移取20 µL、50 µL、100 µL、200 µL、500 µL 和 1 000 µL工作液至10 mL容量瓶，猪肉空白基质定容，浓度分别为2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL。

1.2.2 样品前处理

称取猪肉样品5.0 g，加20 mL 0.1 mol/L EDTAMcllvaine缓冲溶液，涡旋1 min，超声10 min，10 000 r/min离心5 min（4 ℃），提取3次，合并上清液。将待净化的上清液全部转移到已活化的HLB柱（200 mg，6 mL），弃去滤液，用2 mL 5%甲醇水淋洗，抽干小柱，用6 mL甲醇洗脱并收集。氮气吹干，用1 mL 0.2%甲酸水复溶，涡旋1 min，过0.22 µm滤膜，上机测定[1]。

1.2.3 色谱条件

C18色谱柱：50 mm×2.1 mm，1.9 µm；柱温：40 ℃，流速：0.2 mL/min；流动相：乙腈-0.2%甲酸水。

1.2.4 质谱条件

电离模式：ESI+；扫描方式：MRM；离子喷雾电压：500 V；离子化温度：300 ℃[2]。

1.3 结果计算

环丙沙星的计算公式如下：

式中：X为样品中组分含量，µg/kg；c为测定液中组分浓度，ng/mL；V为定容体积，mL；m为样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

不确定度的来源分析如图1所示。

图1 测定猪肉中环丙沙星的不确定度来源

2.2 不确定度的评定

2.2.1 样品称量引入的相对标准不确定度ur(W样)

根据天平检定证书，当称量5.00 g时，最大允许误差为0.02 g，假设均匀分布，试验称量样品的平均质量为5.02 g，则样品称量引入的相对标准不确定度为：

2.2.2 样品溶液定容引入的相对标准不确定ur(V样)

样品溶液定容使用1 000 µL移液器，根据《移液器检定规程》，移液器的容量允差为0.000 2 mL，假设均匀分布，则样品溶液定容引入的相对标准不确定度为：

2.3 仪器引入的相对标准不确定度ur(E液质)

根据液质校准证书，峰面积测量重复性为1.2%，假设均匀分布，则仪器引入的相对标准不确定度为：

2.4 测量重复性引入的相对标准不确定度ur()

平行制备10份样品进行测定，结果见表1。由表1可知，测量重复性引入的相对标准不确定度为：

表1 样品检测结果

2.5 回收率引入的相对标准不确定度ur(R)

对加标样品进行测定，回收率分别为93.52%、94.22%、95.36%、93.18%和92.40%。根据t检验，则回收率引入的相对标准不确定度为：

当置信度为95%，n-1=4，查t值临界值表：t（0.05，4）=2.776，与13.69相比，需要回收率校正[3]。

2.6 标准溶液纯度引入的相对标准不确定度ur(P标)

环丙沙星标准溶液不确定度为0.10 µg/mL，按均匀分布，标准溶液纯度引入的相对标准不确定度为：

2.7 标准工作曲线配制引入的相对标准不确定度ur(V标)

配制过程使用容量瓶8次（10 mL）、1 000 µL移液枪（分别移取 100 µL、200 µL、500 µL 各 1 次，1 000 µL 3次），50 µL 移液枪（分别移取 20 µL、50 µL各1次），依据《常用玻璃量器检定规程》和《移液器检定规程》，假设均匀分布[4]，结果见表2。

表2 玻璃量器和移液器引入的不确定度

2.8 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度ur(C标)

配制6种浓度，每个浓度测定1次，见表3。计算标准溶液峰面积残差的标准差，m为每个浓度检测次数，m=1；n为标准曲线浓度点数[5]，n=6。

表3 标准曲线测量数据

标准溶液工作曲线配制过程引入的相对标准不确定度为：

式中：a为线性方程斜率；p为样品溶液检测次数，平行样为2；n为标准溶液检测总次数，6×1=6；为样品溶液浓度平均值，51.19 ng/mL；C—为标准曲线配制浓度平均值，31.167 ng/mL；C实为标准溶液实测浓度，ng/mL。

2.9 扩展不确定度

环丙沙星的合成相对标准不确定度ucr(X)和合成不确定度uc(X)计算如下：

扩展不确定度U=k·uc(X)，取包含因子k=2，扩展不确定度U=1.75 µg/kg。

3 结论

测定猪肉中环丙沙星残留量的不确定度影响因素包括仪器的稳定性、标准溶液纯度和配制以及前处理重复性等。通过评定发现，其中影响最大的为标准曲线拟合，试验中可以通过增加标准曲线检测次数、标准曲线点数等，减小标准曲线拟合引入的不确定度，进而减小最终结果的不确定度，提高实验准确性。