佘玉婷　丁勇

摘  要：下胚軸伸长是高等植物进行正常生命活动的保障，下胚轴的伸长协助植株破土而出并由异养转变为自养生长。本研究通过对一系列拟南芥突变体材料进行下胚轴观察，鉴定到一个具有短下胚轴的突变体，并对其调控下胚轴伸长的分子机制进行初步探索。结果表明：编码与酵母中同源的丝裂原活化蛋白激酶，在MAPK级联信号通路中作为MAP4K激活下游的MAP3K。基因型鉴定和半定量结果显示，、均为功能缺失的突变体。通过表型观察，突变体无论在长日照（16 h光照/8 h黑暗）、短日照（8 h光照/16 h黑暗）及黑暗（24 h黑暗）条件下与野生型相比均呈现出短的下胚轴。细胞学结果显示，突变体短的下胚轴是由于其细胞长度的变短而不是细胞数目的变化导致的。植物激素赤霉素可促进下胚轴的伸长，对其处理的敏感性可作为是否参与GA信号转导途径的判断方法。在不同梯度浓度的GA处理（0、0.5、1、2、5 µmol/L）下，突变体与野生型相比下胚轴伸长作用不明显。多效唑（PAC）是内源GA合成的抑制剂，随着不同梯度浓度的PAC处理（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 µmol/L），突变体下胚轴伸长的抑制作用相对于野生型不明显。上述生理学结果表明，参与到GA信号转导通路中调控拟南芥下胚轴的生长发育。将STE20L4蛋白与荧光标签融合后转染烟草或拟南芥原生质体观察其亚细胞定位，结果表明STE20L4在细胞膜和细胞质中均有表达。对野生型、突变体中进行一系列GA下游与下胚轴伸长相关基因的RT-qPCR检测，结果表明、、、、和基因的转录水平在突变体中明显下调，即可能通过间接调控这些下游基因的表达参与下胚轴的伸长。综上，参与GA信号转导通路，且通过促进GA下游下胚轴伸长相关基因的表达调控下胚轴的伸长。本研究初步阐述了调控植物下胚轴伸长的分子机制，为进一步研究MAPK与GA互作调控植物生长发育提供参考。

关键词：;下胚轴;GA;PAC;细胞长度中图分类号：S565.9      文献标识码：A

Mechanism Study ofin Promoting Hypocotyl Elongation of

SHE Yuting DING Yong

School of Life Sciences， University of Science and Technology of China， Hefei， Anhui 230027， China

Hypocotyl elongation assists plants to break through the soil and changes from heterotrophic to self-sustaining， which is the guarantee of normal life activities of higher plants. In this study， a mutant with shorter hypocotyl was identified by observing the hypocotyl of a series of mutants in our laboratory and the molecular mechanism of regulating hypocotyl elongation was preliminarily explored. ， as a MAP4K， encodes a mitosis-activated protein kinase homologous to in yeast and activates downstream MAP3K in the MAPK cascade signaling pathway. Genotyping identification and semi-quantitative results showed that and were mutants with loss of function. Through phenotype observation， the mutant shows a short hypocotyl either in long daylight （16 h light/8 h dark）， short daylight （8 h light/16 h dark） and dark （24 h dark） conditions compared with the wild type. Cytological results showed that short hypocotyl of mutants were due to a shortening of cell length rather than a change in cell number. The plant hormone gibberellin can promote the elongation of the hypocotyl and the sensitivity to its treatment can be used as a method of judging whether to participate in the GA signal transduction pathway. Under different gradient concentrations GA （0， 0.5 µmol/L， 1 µmol/L， 2 µmol/L and 5 µmol/L） treatment， the hypocotyl elongation of mutants were not significant compared with the wild type. Paclobutrazol （PAC） is an inhibitor of endogenous GA synthesis， with gradient concentrations PAC （0， 0.01 µmol/L， 0.02 µmol/L， 0.05 µmol/L， 0.1 µmol/L， 0.2 µmol/L， and 0.5 µmol/L） processing ， the inhibition of hypocotyl elongation in mutants were also less pronounced than wild type. The above physiological results show that is involved in regulating the growth and development of hypocotyl in the GA signal transduction pathway. After fusing the protein of STE20L4 with fluorescent tags， we transfected them into tobacco and protoplasts to observe subcellular localization， the results showed that STE20L4 was expressed in both cell membranes and cytoplasm. A series of RT-qPCR of GA downstream genes associated with hypocotyl elongation were tested in the wild-type and mutants. The results showed that the transcriptional levels of ， ， ， ， and genes were significantly downregulated in the mutant， suggesting may participate in hypocotyl elongation by indirectly regulating the expression of these downstream genes. In summary， participates in the GA signal transduction pathway and regulates hypocotyl elongation by promoting the expression of hypocotyl elongation-related genes downstream of the GA. Our study preliminarily elaborated the molecular mechanism of regulating plant hypocotyl elongation， which provides a reference for further study of the interaction between MAPK and GA to regulate plant growth and development.

; hypocotyl; GA; PAC; cell length

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.006

植物的整个生活史包括胚胎形成、种子萌发、下胚轴伸长，营养生长、生殖生长、果实成熟及衰老等过程。下胚轴是连接子叶和根的胚性部分，保证水分、无机盐、营养物质和激素等物质的顺利运输。下胚轴伸长是长期自然选择的结果，其伸长协助了幼苗出土这一过程，同时也是植物进行光合作用、实现自养的必要前提，但下胚轴过度伸长容易造成幼苗徒长，抗逆性能力差，不利于产量提高和品质改良。因此，合适的下胚轴伸长是植物进行正常生命活动的保障。

下胚轴的伸长受环境因子和多种内源激素的综合调控。其中，光强与光质调控下胚轴细胞伸长的机制类似，主要是通过光受体PHYA、PHYB、CRY1和CRY2调控PIFs，进而影响下游基因的表达，从而实现对下胚轴伸长的调控。温度调控机制也主要依赖于PHYB，高温促使细胞核中的PHYB由Pfr（生理活跃型）向Pr（生理失活型）转变，并向细胞质中迁移，从而解除其对PIFs及COP1-SPA的抑制作用，诱导下胚轴细胞伸长。植物激素如赤霉素、生长素、独脚金内酯等均参与调控下胚轴伸长的过程。赤霉素（GA）主要通过调控DELLA蛋白含量影响下胚轴细胞的伸长。生长素（IAA）通过与TIR1结合，进而促进AUX/IAAs蛋白结合到SCF-Auxin复合体中泛素化降解，解除其对ARF的转录抑制作用从而影响下胚轴细胞的伸长。独脚金内酯（SLs）通过信号转导蛋白MAX2促使光信号转导关键因子表达上调，HY5蛋白积累能促使植物光形态建成，抑制下胚轴伸长。

自20世纪60年代起，“绿色革命”中半矮化育种的大规模推广大幅度地提高了世界主要粮食作物的产量。水稻和小麦的“绿色革命”均与赤霉素密切相关。赤霉素是一类双萜类化合物的植物激素，在植物整个生命周期中均起着重要作用，在种子萌发、叶片伸展、茎和根的伸长、花和果实的发育等方面均起到了重要的调控作用。GA主要通过细胞伸长的方式促进下胚轴的生长。DELLA蛋白是GA信号转导的关键作用元件，能与一类bHLH类转录因子结合，导致其转录激活作用受到阻遏，从而抑制光形态建成。植株在缺失GA的情况下，DELLA蛋白会累积到较高水平，抑制转录因子活性，从而抑制GA调节的下游基因表达;在受到GA诱导的情况下，GA与受体GID1结合，促进GID1与DELLA蛋白结合，导致DELLA蛋白与SCF复合体相互作用继而被泛素化，最终通过26S蛋白酶体途径降解，解除其对下游转录因子活性的抑制作用。

MAPK通路在动物中已经被研究证明是多种信号通路的中心，可用来接收胞外的信号并将其传递给胞内，并最终被带入细胞核中。经典的MAPK信号通路通过MAP3K、MAP2K、MAPK的级联磷酸化的过程逐级激活和传递信号。MPK3/MPK6是拟南芥MAPK核心成员，在调控植物生长发育及对生物和非生物胁迫的响应中发挥着重要作用。然而关于MAPK信号更为上游的MAP4K家族的研究报道很少，拟南芥中共有10个MAP4Ks，其功能直到2013年才有研究报道。本研究选取表型较为明显的MAP4K4作为研究对象，作为酵母中的的同源基因，已有研究表明STE20可将酵母的组蛋白H2BS10磷酸化，最终影响酵母的细胞周期。为了研究方便，将其命名为STE20-Like-4（）。近年来，有研究表明能够参与免疫调节，通过磷酸化PP2C38从而激活BIK1，协同SIK1共同调节flg22诱导的免疫应答。另一研究表明，通过参与到油菜素内酯信号途径调控拟南芥热形态建成。因此，本研究将进一步探索是否可以整合其他植物激素调节植物的生长发育过程。

本研究发现功能缺失的突变体表现出短的下胚轴，对GA和PAC的处理不敏感，表明其参与GA的信号转导过程。STE20L4定位于细胞质和细胞膜，并通过下游细胞伸长相关基因调节细胞伸长和下胚轴的伸长。综合运用遗传分子细胞等手段阐述了和赤霉素信号协同参与细胞伸长过程，丰富了植物生长发育调控网络。

材料与方法

  材料

（Salk_086087）和（Salk_ 065417）突变体订购于美国ABRC（Biological Resource Center）突变体库，拟南芥（L）于22℃中，光周期为16 h光照/8 h黑暗的温室培养。

方法

1.2.1  下胚轴长度测量  将供试材料种子无菌处理后均匀地点在1/2 MS培养基上，4℃吸水2～3 d，按照所需要的拟南芥生长环境培养一周左右（注意光照不宜过強），用镊子将下胚轴按倒在培养皿上，用莱卡m165c体视镜测量每一个下胚轴的长度，莱卡体视镜配套软件中直接有距离尺软件，统计下胚轴长度。

1.2.2  GA与PAC敏感性处理  在1/2 MS培养基上设置不同的GA浓度梯度（0、0.5、1、2、5 µmol/L）与PAC浓度梯度（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 µmol/L），将所需要处理的突变体和对照组均匀地点在培养基上，4℃吸水2～3 d，按照所需要的拟南芥生长环境培养一周左右（注意光照不宜过强），再用莱卡m165c体视镜统计下胚轴长度。

1.2.3  蛋白定位  原生质体：将STE20L4蛋白的CDS序列构建到PUC19-eGFP载体中，提取较高纯度的质粒。将质粒转入拟南芥原生质体中，黑暗培养10～12 h，在共聚焦显微镜（ZEISS Xradia 880）下观察定位。

烟草：将STE20L4蛋白的CDS构建至1300-eGFP载体上，瞬转烟草常温避光保温36～ 48 h。撕取注射菌液的烟草下表皮细胞于激光共聚焦显微镜下观察相应荧光的定位。

1.2.4  基因型鉴定  根据T-DNA插入选用的不同载体设计中间引物（SALK系列中间引物BP为LBb1.3），然后通过T-DNA Primer Design网站查询插入位点的上游引物LP和下游引物RP（表1）。以提取的基因组作为模板，使用上游引物、中间引物和下游引物进行PCR鉴定。

野生型（未插入）只能得到1条约1100 bp的条带，纯合突变体也只能得到1条约500～ 800 bp的条带。PCR反应体系：总体系为20 µL，其中模板1 µL，10×Easytaq buffer 2 µL，Easytaq酶0.2 µL，上下游引物各0.4 µL，10 mmol/L dNTPs 0.4 µL，ddHO 15.6 µL。扩增程序：94℃预变性3 min;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1～2 kb/min，共34个循环;最后72℃充分延伸8 min。

1.2.5  RNA提取、半定量及Q-PCR分析  RNA提取：取生长一周左右的野生型和突变体材料约0.1 g，采用Trizol（TransGen Bio-tech）试剂提取植物叶片总RNA，并反转录为cDNA。

半定量检测：参照PCR程序分别扩增内参基因（TUBLIN）和待检测靶基因，不断调整模板的比例，使得内参基因PCR产物亮度基本一致，再以等比例的DNA模板，选取适当的PCR扩增圈数比较野生型与突变体靶基因扩增的亮度。

Q-PCR分析：采用SYBR superMix试剂盒（TransGen Bio-tech），在定量PCR仪（Bio-Rad）上扩增，以UBQ10为内参，并通过2法计算相对表达量。Q-PCR反应体系：总体系为20 µL，其中cDNA 3 µL，2×Q-PCR mix 10 µL，上下游引物各0.2 µL，ddHO 6.6 µL。扩增程序：95℃预

变性3 min;95℃变性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环;融解曲线：95℃（预变性）10 s，65℃（退火温度）5 s，下个循环预变性温度不变，退火温度依次+1℃，共31个循环，反应终止。

结果与分析

2.1  突变体获得及表型观察

为了研究STE20L4蛋白的功能，本研究获得2个T-DNA插入的突变体和，基因的结构示意图见图1A，突变体插入在基因第2位外显子上，突变体插入在基因第8位外显子上。基因型分析结果可看出，和均是T-DNA插入的纯合突变体（图1B）。半定量检测转录水平结果也显示，和均为功能缺失突变体（图1C）。在长日照（16 h光照，8 h黑暗）下通过表型观察，突变体与野生型相比开花上没有明显表型，但整体植株较小（图1D～图1E）。将Col-0、和在1/2 MS固体培养基上培养7 d，观察下胚轴表型，统计样本超过40株。由图2可知，在短日照、长日照及黑暗条件下，突变体均明显表现出短下胚轴表型，这表明可能参与到赤霉素调控途径中。

2.2  参与信号转导通路

本研究检测了野生型和突变体的下胚轴细胞长度和细胞数目。Col-0、和下胚轴在长日照条件下生长7 d后，用PI（碘化丙啶）染色，激光共聚焦显微镜扫描细胞长度。结果表明，与野生型下胚轴细胞相比，突变体的下胚轴长度明显变短，而统计的下胚轴细胞个数无明显差异（图3A～图3C），说明突变体的短下胚轴表型是由细胞长度变短导致。赤霉素可促进植物下胚轴的伸长，用梯度浓度的GA（0、0.5、1、2、5 µmol/L）處理野生型、突变体和三突变体（三突为GA/PAC不敏感的正对照），以Col-0对GA的敏感程度当作100%，各突变体对GA的敏感程度均相较于野生型不明显。由图4A～图4B可知，随着GA浓度的升高，野生型的下胚轴长度明显伸长，而、与的下胚轴长度增长幅度明显变小，表现出对外源GA处理不敏感的表型。为进一步验证此结论，本研究使用不同浓度的内源GA合成抑制剂PAC（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 µmol/L）处理Col-0、、和。同样，以Col-0对PAC的敏感程度当作100%，各突变体对PAC的敏感程度均相较于野生型不明显。由图4C～图4D结果显示，野生型下胚轴随着PAC浓度升高明显变短，而、与的下胚轴变短的幅度小。由此确定参与到GA信号转导通路中，并调控拟南芥下胚轴的生长发育。

的定位觀察

本研究将STE20L4与GFP标签融合，瞬时转染烟草。绿色荧光信号显示，STE20L4蛋白主要定位在细胞膜和细胞质中（图5A）。同时，将STE20L4与GFP和tagRFP标签融合，分别转染拟南芥原生质体。荧光观察发现，无论是融合绿色的荧光标签还是红色荧光标签，STE20L4蛋白均定位于细胞膜上（图5B），这与JIANG等的研究结果一致。这表明正常情况下STE20L4不在细胞核内发挥功能。

2.4  促进下胚轴伸长相关基因的表达

本研究检测了很多与细胞伸长相关的下游基因，看其是否受STE20L4的调控。取生长约一周大小的野生型和突变体材料，提取RNA并反转录为cDNA，利用RT-QPCR检测GA下游基因的表达，结果显示很多基因如、、、、、在突变体中下调表达（图6）。这一结果与相应的下胚轴表型一致，表明可有效激活细胞伸长相关基因的表达，并参与到GA信号通路中促进下胚轴的伸长。

 讨论

研究植物下胚轴伸长的调控机制，有助于深入了解植物生长发育规律和提高农业产益。MAP激酶途径介导对各种刺激的反应，包括有丝分裂原和不同类型的应激。虽然我们对植物MAP4Ks的了解在逐渐增加，但对它们的功能及其调控机制仍鲜有报道。JIANG等曾报道（）参与植物的免疫调节应答从而抵抗病原菌的侵染。最近的报道还发现在温暖温度下影响油菜素内酯（BR）介导的下胚轴伸长。本研究则显示突变体在拟南芥正常生长温度（22℃）下也表现为较短的下胚轴表型，并且这一表型不受光周期途径的变化而变化，同时发现可参与到GA信号转导通路中调控拟南芥下胚轴细胞的伸长过程。DELLA蛋白可整合多种植物激素来调控PIFs从而调控下胚轴的伸长，那么既参与BR信号通路又参与到GA信号通路中，是否介导多种植物激素之间的crosstalk从而调控植物的生长发育过程，还需要更多强有力的实验来证实。经典的GA信号转导通路是通过调控核定位蛋白DELLA的降解从而调控植物的生长，而STE20L4主要定位于细胞膜中，是否存在某种信号或与某个蛋白的相互作用，使其定位发生动态变化进而与DELLA蛋白产生关联，还需进一步的探究。此外，虽然参与GA信号转导通路且突变体中下胚轴伸长相关基因下调，但并不能说明仅通过GA依赖的方式调控下胚轴的伸长，不排除直接调控下游基因的可能性，下一步将从遗传学上判断其上下游关系，而这些基因的启动子是否可被直接靶向结合等更为精细的分子机制还有待进一步的研究。

目前尽管已在植物激素调节拟南芥生长发育过程方面取得了巨大进展，但关于植物激素如何协同蛋白激酶共同调控单子叶植物下胚轴伸长的模式研究仍处于起步阶段。因此，有必要进行更深入的研究来揭示和阐明丝裂原活化蛋白激酶与不同植物激素的局部合成、感知、转运及其串扰对拟南芥生长发育的调控作用。而拟南芥中已取得的成果可作为今后研究的铺垫，有助于增强作物的适应性反应及提高作物产量。

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