硫醚类香料对沙门氏菌和副溶血性弧菌的抑制作用

2022-07-19周倩倩毕景然郝洪顺侯红漫张公亮

中国食品学报 2022年6期

张珂，周倩倩，毕景然，3，郝洪顺，侯红漫，3，张公亮，3*

（1 大连工业大学食品学院辽宁大连 116034 2 大连工业大学纺织与材料工程学院辽宁大连 116034 3 辽宁省水产品加工质量安全与控制重点实验室辽宁大连 116034）

近年来，由微生物引起的食物中毒越来越多，引起人们对食品安全问题的高度重视。一直以来都在使用抗生素治疗食源性食物中毒，使细菌产生了耐药性，作用效果明显降低[1]。亟需利用天然物质来预防和控制食源性致病菌的污染和传播。含硫香料是一种天然食品添加剂，常见于十字花科植物，具有食用安全、阈值低、特征性强等特点，并具有抗癌、抗菌等活性。硫醚类香料是含硫香料的一种，常见于葱属植物，化学通式为R-S-R。大蒜是一种公认的功能性食品，摄入大蒜被证实可通过降低癌症风险等改善人类健康，且大蒜中的一些成分具有抗血栓、预防心血管疾病、抗菌、抗癌、抗病毒、抗氧化等作用[2-3]。大蒜不仅可作为食物，还具有多种活性成分，得到广泛应用[4-5]。大蒜油的蒸馏产物中含有多种硫醚类化合物，如二烯丙基硫醚（DAS）、烯丙基三硫醚（DATS）、二烯丙基二硫醚（DADS）等[4，6-7]。

沙门氏菌（Salmonella）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是两种典型的革兰氏阴性食源性致病菌。沙门氏菌常见于肉类，也存在于新鲜的水果蔬菜中，甚至可在土壤、粪便、水等环境中存活很久，它所引起的食物中毒在微生物性食物中毒中占很大比例[8-11]。副溶血性弧菌中等嗜盐，主要呈弧状、短棒状等，常见于水产品及沿海环境中，与海鲜有关的细菌性肠胃炎主要是由副溶血弧菌直接或交叉污染引起的[12-13]。tdh 基因是副溶血性弧菌重要的毒力基因之一，它编码耐热性溶血毒素（TDH），从而溶解红细胞，产生神奈川现象，是判断副溶血性弧菌是否具有致病性的依据，可使菌体具有耐热性并引起腹泻等一系列症状[14-15]。鉴于此，有必要采取各种措施来减少沙门氏菌和副溶血性弧菌的污染。学者们发现，肉桂醛、香榧壳精油以及二氢杨梅素等天然物质可以抑制沙门氏菌和副溶血性弧菌[16-17]，异硫氰酸酯类香料也对这两种菌有一定抑制作用[18]，异硫氰酸苄酯（BITC）可以通过对毒力基因的调控来抑制这两种菌的毒性[19-20]。目前尚无硫醚类香料对沙门氏菌和副溶血性弧菌抑菌作用的研究。

本研究根据GB 2760-2014 食品安全国家标准食品添加剂使用标准，从中选取较常见的10种硫醚类香料，从抑菌活性、最小抑菌浓度、生长曲线等多个方面分别研究它们对于沙门氏菌以及副溶血性弧菌两种食源性致病菌的抑菌作用，并通过对比它们对这两种菌抑制作用的不同，探讨硫醚类香料结构对其的抑菌效果，从而筛选抑菌效果最好的香料。通过qRT-PCR 试验，研究硫醚类香料作用下，副溶血性弧菌tdh 毒力基因的表达量差异，为天然含硫香料应用于食源性致病菌的防治以及作为食品用抑菌剂提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 硫醚类香料

选出10 种硫醚类香料（表1），均购自美国Sigma 公司。

表1 10 种硫醚类香料的名称及结构Table 1 Name and structure of 10 kinds of sulfide flavors

1.2 菌种及试剂

鼠伤寒沙门氏菌株（Salmonella，ATCC 14028），副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，CGMCC 1.1614），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

RNA 提取试剂盒、溶菌酶、蛋白酶K、溴化乙锭（EB）等，北京天根生化有限公司；DNA Marker、6×Loading Buffer、5×M-MLV Buffer、RTase MMLV（RNase H-）、RNase Inhibitor、dNTP Mixture等，宝生物工程（大连）有限公司；DEPC Water、50×TAE、RNase-freeWater 等，生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、牛肉膏等，北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.3 仪器及设备

YC-L 型层析实验冷柜，北京博医康实验仪器有限公司；ZHJH-C1112C 型超净工作台、ZHWY-100B 型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；01J2003-04 型高压灭菌锅，上海博讯实业有限公司；MyiQTM2 型荧光定量PCR 仪，美国BIO-RAD 公司；UV-1750 型紫外分光光度计，日本岛津仪器有限公司；202-OAB 型电热恒温干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；DRP-9162 型电热恒温培养箱、DGG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司。

1.4 样品处理及菌种活化

利用硫醚类香料的原液密度和分子质量，求出稀释所需的无水乙醇，并稀释成浓度为5 mol/L的预混液备用。

于液体培养基中添加适量冷冻保存的菌种，并在37 ℃、150 r/min 摇床振荡培养24 h。用上述菌液涂布平板，再次活化培养制成108CFU/mL 的菌悬液，备用。

1.5 抑菌活性的测定

根据张公亮等[21]采用的滤纸片法，取100 μL菌悬液涂布平板，平板中央放置直径10 mm 的圆形滤纸片，滴加用乙醇稀释好的不同浓度的硫醚类香料，37 ℃培养箱过夜培养。阴性对照滴加同等体积的无水乙醇，重复3 次并取平均值。

1.6 最小抑菌浓度（MIC）的测定

根据1.5 节的试验结果，以二烯丙基二硫醚（DADS）为研究对象，利用倍比肉汤稀释法[22]，用乙醇将该香料从5 mol/L 稀释到0.61 mmol/L，将不同浓度的香料、菌悬液按照一定比例分别加入到试管装液体培养基中，37 ℃培养24 h。取培养好的液体进行涂板培养并观察，阳性（+）表示培养基上有菌生长，阴性（-）则无菌生长。MIC 即为无细菌生长的最小含硫香料浓度。试验重复3 次。

1.7 生长曲线的测定

向液体培养基中加入1 mL 浓度为108CFU/mL 的菌液及不同浓度的DADS，于37 ℃摇床下振荡培养，每2 h 测定其600 nm 下的吸光值，并以吸光值为纵坐标，以时间（h）为横坐标绘制生长曲线。

1.8 细菌总RNA 的提取及检测

根据天根生化有限公司细菌总RNA 提取试剂盒的方法[23]，提取经不同浓度香料处理12 h 后副溶血性弧菌的总RNA，并用分光光度计对RNA浓度及纯度进行检测。

1.9 qRT-PCR 法测定DADS 对副溶血性弧菌毒力基因表达的影响

目的基因为tdh，内参基因为16S rRNA，引物序列如表2所示，并由生工生物工程股份有限公司合成。根据试剂盒对RNA 进行反转录，并以总体系为25 μL 来进行qRT-PCR 反应，其中SYBRR Premix Ex TaqTM12.5 μL，引物对各0.5 μL，DEPC Water 9.5 μL，cDNA 模板2 μL。参数设置：95 ℃1 min；95 ℃20 s，62 ℃20 s，于80 ℃处停留15 s，收集荧光信号，循环40 次；在60～95 ℃范围建立熔解曲线。通过2-⊿⊿CT计算tdh 基因相对表达量[24]。

表2 荧光定量PCR 基因引物序列Table 2 The primers for qPCR

1.10 统计学分析

利用http：//www.physics.csbsju.edu/stats/t-test.html 在线软件进行student's t 检验进行显著性分析，P＜0.05 具有显著差异性，且P＜0.01 具有极显著差异性。以平均值±标准偏差来呈现数据。

2 结果与分析

2.1 硫醚类香料对沙门氏菌和副溶血性弧菌的抑菌效果

10 种硫醚类香料，在结构上具备几个特点。一部分为对称性硫醚类香料，如二丙基二硫醚（DPDS）、二甲基三硫醚（DMTS）、二烯丙基硫醚（DAS）、二烯丙基二硫醚（DADS）和双（2-甲基-3-呋喃基）二硫醚（BMFDS）等，侧链取代基及硫原子个数不同。还有一部分含有呋喃环，如2-甲基-3-甲硫基呋喃（MMTF）等。其中一些为同分异构体，如甲基2-甲基-3-呋喃基二硫醚（MMFDS）、甲基糠基二硫醚（MFDS），化学式均为C6H8OS2。

5 mol/L 的各硫醚类香料对两种菌的抑制效果见表3。可以看出，甲基丙基二硫醚（MPDS）、二丙基二硫醚（DPDS）、二甲基三硫醚（DMTS）、二烯丙基硫醚（DAS）、二烯丙基二硫醚（DADS）、2-甲基-3-甲硫基呋喃（MMTF）、糠基异丙基硫醚（FIPS）、甲基2-甲基-3-呋喃基二硫醚（MMFDS）、甲基糠基二硫醚（MFDS）和双（2-甲基-3-呋喃基）二硫醚（BMFDS）这10 种硫醚类香料对副溶血性弧菌都有不同的抑制效果，而二甲基三硫醚（DMTS）、甲基2- 甲基-3- 呋喃基二硫醚（MMFDS）、二丙基二硫醚（DPDS）、2-甲基-3-甲硫基呋喃（MMTF）、双（2-甲基-3-呋喃基）二硫醚（BMFDS）和对沙门氏菌不具备抑菌能力。副溶血性弧菌比沙门氏菌对上述硫醚类香料更加敏感。

表3 硫醚类香料对供试菌的抑制效果Table 3 Inhibitory effect of sulfide flavors on the tested bacteria

2.2 硫醚类香料对沙门氏菌的抑制作用

图1为5 种对沙门氏菌有抑菌效果的硫醚类香料的抑菌圈结果，包括MPDS、DADS、DAS、MFDS 和FIPS，它们的抑制作用大小为DADS＞MFDS＞（MPDS≈DAS≈FIPS）。其中DADS 的抑菌圈直径最大，为（1.54±0.04）cm，即抑菌效果最好，其次是直径为（1.36±0.08）cm 的MFDS，而剩下的3 种硫化物MPDS、DAS 和FIPS 抑菌圈直径几乎相同。DADS 的抑菌活性比MPDS、DAS 显著增高（P＜0.05），DADS 与MPDS 相比，多了两个烯丙基，DADS 与DAS 相比，多了一个硫原子，可见硫醚类香料对沙门氏菌抑菌作用受到硫原子个数和烯丙基的影响。且含有呋喃基的对称性硫醚类香料，如BMFDS 对沙门氏菌没有抑制效果。

图1 硫醚类香料对沙门氏菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of thioether spices on Salmonella

2.3 硫醚类香料对副溶血性弧菌的抑制作用

图2为10 种对副溶血性弧菌有抑菌效果的硫醚类香料的抑菌圈。与沙门氏菌相比，有抑菌效果的香料种类更多，且抑菌效果各不相同，其中，DADS、DAS、DPDS、MFDS、FIPS 和BMFDS 对副溶血性弧菌有很好的抑制作用。与沙门氏菌结果一致，DADS 抑制效果最强（P＜0.05），抑菌圈直径达到了（4.49±0.32）cm。与2.2 节的结果相比，硫醚类香料对副溶血性弧菌比对沙门氏菌的抑制效果更显著。DADS 与DPDS 相比，-S-S-侧链两边多了双键，变为烯丙基。DADS 的抑菌活性最好，这说明双键的存在增强了抑制效果。当同分异构体的MMFDS 和MFDS 两者进行分析时，MFDS 的抑菌能力显著强于MMFDS，反映出侧链为糠基抑菌作用强于侧链为呋喃基。

图2 硫醚类香料对副溶血性弧菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of thioether spices on V.parahaemolyticus

2.4 二烯丙基二硫醚对两种菌的MIC

表4为对沙门氏菌和副溶血性弧菌抑菌作用都最强的二烯丙基二硫醚（DADS）对这两种菌的最小抑菌浓度。从表4可以看出，当DADS 浓度大于19.5 mmol/L 时，对两种菌都有很好的抑制作用，且沙门氏菌对DADS 的敏感程度低于副溶血性弧菌。DADS 对沙门氏菌的MIC 为19.5 mmol/L，对副溶血性弧菌的MIC 为4.88 mmol/L。

表4 二烯丙基二硫醚对供试菌的MICTable 4 Minimum concentration of diallyl disulfide on tested bacteria

2.5 二烯丙基二硫醚对两种菌生长曲线的影响

测定二烯丙基二硫醚（DADS）对沙门氏菌和副溶血性弧菌生长曲线的影响。如图3所示，空白组的沙门氏菌生长曲线呈S 型，而在MIC 浓度的DADS 作用下OD 值没有明显改变，即细菌几乎不生长。当添加的DADS 浓度为1/2 MIC 时，很大一部分细菌无法生长，且延滞期较长。1/4 MIC 浓度下细菌与空白组差距很小，但仍有一部分细菌的生长受到抑制。综上，沙门氏菌的生长受DADS 的影响呈现出浓度依赖性。

图3 DADS 对沙门氏菌生长曲线影响Fig.3 Effect of diallyl disulfide on the growth curve of Salmonella

如图4所示，与沙门氏菌生长曲线图结果一致，与空白组相比，MIC 浓度的DADS 作用下，副溶血性弧菌的生长完全被抑制，当DADS 浓度为1/2 MIC 时，大部分菌的生长被抑制，当浓度逐渐

图4 DADS 对副溶血性弧菌生长曲线影响Fig.4 Effect of diallyl disulfide on the growth curve of V.parahaemolyticus

2.6 二烯丙基二硫醚对副溶血性弧菌tdh 毒力基因表达的影响

选取对副溶血性弧菌有明显抑菌效果的DADS，分析经不同浓度DADS 作用后tdh 毒力基减小为1/4 MIC 时，菌的生长与空白组差异较小，呈现出明显的浓度依赖性。因的表达量差异。结果如图5所示，不同浓度DADS 处理过的副溶血性弧菌中tdh 的表达量不同，随着DADS 浓度的增加，tdh 毒力基因的相对表达量逐渐降低，与DADS 浓度呈负相关。与空白组相比，1/64 MIC 浓度的DADS 作用后tdh 基因表达量有所降低，但无显著性差异。而DADS 浓度以二倍递增，当副溶血性弧菌被这些亚抑制浓度的DADS 作用后，毒力基因tdh 的表达量变化差异都极显著，且当DADS 浓度为1/4MIC 时，tdh 毒力基因下调了4.4 倍。由此可知，二烯丙基二硫醚对副溶血性弧菌tdh 毒力基因的作用效果呈剂量依赖性。