彭银琪　刘雁　禹利君

摘要：將莓茶与黑茶以不同配比得到系列莓茶黑茶复合物，接种冠突散囊菌发花，探究“金花”莓茶复合黑茶的抑菌能力及品质成分变化。通过纸片抑菌实验，感官审评及HPLC分析方法，发现复合茶对青霉初期生长有一定抑制作用，随着青霉快速生长其抑制作用减弱，对其生长无明显抑制作用;对大肠杆菌抑制作用显著，对黑曲霉生长不能起到有效抑制。莓茶复合发花黑茶较不发花黑茶，味更醇，色泽更艳;生物碱、总儿茶素含量显著下降（P<0.01）;GCG含量显著增加，莓茶复合发花黑茶样比黑毛茶样含量上升了1 927.31%（P<0.01）;没食子酸含量显著增加，上升幅度最大为462.69%（P<0.01）。

关键词：莓茶复合发花黑茶;冠突散囊菌;抑菌作用;品质成分

中图分类号：S379.5 文献标识码：A 文章编号：1004-3020（2022）03-0025-07

Analysis of Anti-Bacterial and Quality Components Contents Varieties of Ampelopsis grossedentata-Dark Tea Compounds With Eurotium cristatum Fermentation

Peng Yinqi Liu Yan Yu Lijun

（1.Xiangxi Open UniversityJishou416000;

2.Yiyang Testing Institute of Product and Commodity Quality SupervisionYiyang413000;

3.Department of Tea Science， College of Horticulture， Hunan Agricultural UniversityChangsha410128）

Abstract：In order to research anti-bacterial and quality components contents varieties of Ampelopsis grossedentata-dark tea compounds with E. cristatum fermentation， blending different proportion of A. grossedentata and dark tea and inoculating composite A. grossedentata-dark tea with E. cristatum. Paper anti-bacterial test showed that A. grossedentata-dark tea compounds with E. cristatum fermentation could inhibit Penicilliumin sp. during its earlier stage growth， but with the rapid growth of P. sp.， the inhibitory effects was weakened; cannot inhibit Aspergillus niger growth when A. niger produces visible black spores; but significant inhibit Escherichia coli growth. Sensory evaluation results showed that all samples of A. grossedentata-dark tea with E. cristatum fermentation have strong fragrant flowers aroma with E. cristatum， soup color deepened as bright red color， taste mellow than dark tea primary samples. HPLC results showed contents of alkaloid， EGC， EGCG and total catechins declined significantly （P<0.01）， but contents of GCG， gallic acid increased significantly （P<0.01） comparing with dark tea primary samples without E. cristatum fermentation. Consequently， experimental results showed that A. grossedentata-dark tea compounds with E. cristatum’s fermentation have good inhibition ability for Escherichia coli， a certain inhibitory effect for P. sp. and no effective suppression for A. niger. Contents of alkaloid decreased， gallic acid increased， and catechins components fractional conversion make A. grossedentata-dark tea compounds with E. cristatum’s fermentation samples taste more mellow and sweet.

Key words：Ampelopsis grossedentata-dark tea compounds with Eurotium cristatu;Eurotium cristatum; Antifungal and antibacterial activities; quality components

1前言

莓茶，学名显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata 葡萄科蛇葡萄属的野生藤本植物[1]，主要分布于长江以南，又名藤茶、雪茶、甜茶、田婆茶、白茶等[2-3]。幼嫩茎叶杀青、揉捻、干燥后，表面形成的一层“霜”为黄酮类化合物析出晶体，霜状物质越多黄酮类化合物含量越高。其黄酮类物质二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）含量丰富，高达40%以上[4，5]，有降血糖血脂、保肝护肝、抗氧化、降疲劳、抗肿瘤及抗病毒[4-11]等功用。在湖南湘西南作为一种典型的药食两用植物，民间用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、疱疖等症已有数百年历史，具有极高的饮用药用价值。

黑茶是中国最具特色的茶类，在杀青、揉捻后有“渥堆”[12]这一特殊工序，属于后发酵茶。相关研究表明，黑茶在消食去腻、止泻止痢、解毒、降脂及抗动脉粥样硬化、抗氧化、改善胃肠道功能、调节肠道免疫、保肝护肝作用明显[12-15]。茯砖茶因优势菌种——冠突散囊菌Eurotium cristatum，俗称金花而表现出独特的风味及功能[16]，是湖南黑茶特色茶类，冠突散囊菌不仅是茯砖茶中优势益生菌种，还在绿茶、红茶、铁观音、白牡丹等茶叶基质中进行“散茶发花”，获得了成功[17]。非茶类茶物，如银杏叶、桑叶等也通过“散茶发花”技术“发花”成功[18]，丰富了冠突散囊菌生产发花茶类及类茶产品。

茶叶经冠突散囊菌发花后，其茶多酚、氨基酸、水溶性蛋白质和黄酮类物质等呈味物质含量下降，抑菌能力和黑毛茶比较有所下降。如何既保证黑茶具有调节肠胃、降脂减肥的良好功效，又能保持其较高的抗菌、消炎功效，是当前发花黑茶需要解决的技术关键。因此，本研究利用莓茶中含有丰富的二氢杨梅素其良好的抑菌特性，与黑毛茶配比发花，进行复合莓茶黑茶复合物抑菌试验及内含成分变化研究，探究口感合适、黄酮类化合物保高留的黑茶新品，分析莓茶黑茶复合茶开发的可行性。

2材料与方法

2.1材料

2.1.1供试材料

2017年4月中下旬采用湖南农业大学长安基地茶树品种碧香早一芽三、四叶及其同等嫩度对夹叶制备的黑毛茶及湖南湘西永顺县提供的莓茶作为供试材料。冠突散囊菌分离于益阳茶厂的茯砖茶，自行保存;青霉、黑曲霉在分离茶样过程发现并收集;大肠杆菌Escherichia coli由湖南农业大学食品科技学院微生物教研室提供。

2.1.2培养基

马铃薯土豆培养基：超纯水1 L、200 g土豆加适量超纯水熬煮30 min取汁液、加20 g蔗糖及10 g琼脂定容至1 L，121 ℃灭菌30 min后趁热倒平皿备用，用于冠突散囊菌、青霉、黑曲霉的分离培养;LB培养基：5 g酵母提取物、10 g蛋白胨和10 g NaCl，加双蒸水至1 000 mL，5 mol·L NaOH（约0.2 mL）调pH值至7.2，分装后121 ℃灭菌30 min备用，用于大肠杆菌的培养。

2.1.3仪器与设备

701-2型电热鼓风干燥箱（上海实验仪器总厂），LC-2010AHT高效液相色谱仪（岛津）、D8611超纯水器（Thermo Scientific）、AE24电子天平（METTLER）、HH数显恒温水浴锅、SW-CJ-2D型超净工作台。

2.2方法

2.2.1茶样制备

将黑毛茶与莓茶原料先配成一定比例，进行感官审评，选择口感适度的配比进行发花实验。实验样为：①黑毛茶;②发花黑毛茶;③“金花”莓茶复合黑茶复合样Ⅰ（莓茶含量稍低，简称为HM1）;④“金花”莓茶复合黑茶复合样Ⅱ（莓茶含量稍高，简称为HM2）;将2、3、4组茶样按一定含水量接种分离纯化的冠突散囊菌，28 ℃恒温箱培养15 d、烘干，用于抑菌实验、生化成分分析及感官审评。

2.2.2青霉、黑曲霉菌種纯化

在分离纯化冠突散囊菌过程中，茶样中的残余的青霉、黑曲霉伴随着冠突散囊菌一同生长。将青霉、黑曲霉分别挑取，进行3级分离纯化，储藏备用。

2.2.3纸片法抑菌实验

1、2、3、4组分别浸取各自组茶样茶汁，茶汁浓度设置为水∶茶（10∶1），即30 g茶加入300 mL水于三角瓶中高温灭菌25 min后冷却备用。空白组圆形滤纸片作为实验对照，即滤纸片不蘸茶汁、培养基上不接菌种;1、2、3、4组圆形滤纸片分别浸取各自组灭菌冷却的茶样茶汁，每个培养皿涂布50 μL相应的青霉、黑曲霉、大肠杆菌菌液，放入4个浸取了相应茶汁的小滤纸片，每组各有3个平行皿，28 ℃恒温培养，观察青霉、黑曲霉、大肠杆菌的生长快慢及抑菌圈大小。

2.2.4品质成分检测

水分含量采用GB5009.3-2016方法，感官审评采用GB/T23776-2009方法，儿茶素组份及含量采用高效液相色谱法 （high performance liquid chromatography， HPLC）。

2.2.5数据分析

应用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行方差分析，各组间采用最小显著差数法（LSD法）分析;每组设置4个平行，3次重复;统计学数据用均数±标准差（±s） 表示，多个样本均数比较应用单因素方差分析;检验水准α=0.01，α= 0.05。

3结果与分析

3.1“金花”莓茶复合黑茶对青霉、黑曲霉、大肠杆菌生长的影响

滤纸片不蘸茶汁、培养基上不接菌种作为空白对照组，10 d后仍然干净整洁，没有青霉、黑曲霉、大肠杆菌等外源微生物入侵;1、2、3、4组分别浸取各自茶样茶汁，进行青霉、黑曲霉、大肠杆菌生长培养，出现促生长及抑制等实验结果。

3.1.1对青霉生长的影响

各平板涂布1x10～1x106个青霉孢子悬液50 μL，1、2、3、4组滤纸片分别浸取各自茶样茶汁，28 ℃恒温培养，不间断对小滤纸片周围及平皿青霉生长情况观察。从图1（A、B、C）3個代表性时间节点观察结果分析，培养至50 h（图1A），平皿中青霉浅白色、菌落清晰可见;第1组浸黑毛茶其滤纸片周围青霉菌落密度明显大于平皿其它地方;第2组浸发花黑毛茶，上方2个滤纸片周围青霉菌落生长尤为茂密，下方2个滤纸片周围青霉菌落明显聚集;第3组浸HM1“金花”莓茶复合黑茶，右方2个滤纸片青霉生长尤为茂密，左方2个滤纸片周围有少量青霉菌落聚集;第4组浸HM2“金花”莓茶复合黑茶，右下方滤纸片青霉菌落生长尤为茂密，其余3个滤纸片周围右仅少量青霉菌落聚集;其它2平行培养皿对应4个滤纸片周围青霉菌落生长趋势一致。

培养至62 h（图1B），平皿中青霉菌落明显扩增繁殖，白底泛青色;第1组浸黑毛茶其滤纸片周围青霉菌落密度明显大于平皿其它地方，形成了明显突出的青霉同心圆圈;第2组浸发花黑毛茶，4个滤纸片周围青霉菌落尤为茂盛，滤纸片基本上被青霉覆盖住;第3组浸HM1“金花”莓茶复合黑茶，也形成了以滤纸为中心的同心圆，比其它地方更密集，小滤纸片上面也开始布集青霉菌落;第4组浸HM2“金花”莓茶复合黑茶，小滤纸片周围生长情况与第3组相似，但小滤纸片上面基本上没有青霉布集。培养至88 h（图1C），平皿中青霉菌落明显扩增繁殖，菌落颜色基本上转为青色;1、2、3、4组全部形成了以滤纸片为中心的菌落分布密集环，各滤纸片基本上被青霉菌落全覆盖。

从图1A、B、C不同培养时间滤纸片周围青霉分布情况分析可知，在≤50 h培养初期， 1、2组之间青霉生长无明显差异，但添加了莓茶的3、4组青霉生长状况比1、2组差，这是少量莓茶起到了抑菌作用;培养至62 h，3、4组与1、2组青霉菌落分布差异明显缩小;培养至88 h，青霉生长旺盛，1、2、3、4组茶汁浓度不足以使青霉菌落分布产生差异。由此可知，茶汁为青霉生长提供了营养物质，发花其茶汁也为青霉生长提供营养供应，莓茶浸取汁在初期能适度抑制青霉生长，但至青霉生长高峰期，未能起到明显抑制作用。

3.1.2对黑曲霉生长的影响

黑曲霉滤纸片法抑菌实验，各平板涂布1x10～1x10个黑曲霉孢子悬液50 μL，1、2、3、4组滤纸片分别浸取各自茶样茶汁，28 ℃恒温培养，不间断对小滤纸片周围及平皿黑曲霉生长情况观察。因黑曲霉生长速度快，每隔6 h观察1次，至32 h时开始肉眼可观察到黑曲霉，培养32 h、38 h时，不能明显区分白色小菌落是冠突散囊菌或还是黑曲霉。培养44 h，1、2、3、4组的黑曲霉生长均很茂盛，小滤纸片周围厚度明显加深，各平皿纸片周围黑曲霉分布没有明显差异（图2）;总体生长速度比青霉快许多，其平板饱满度优于青霉培养88 h的状况。尤以滤纸片周围，黑曲霉密集度更高，说明莓茶黑茶浸提物为黑曲霉生长提供了营养物质，不能对黑曲霉生长起到抑制作用。

3.1.3对大肠杆菌生长的影响

大肠杆菌过夜培养至其OD值达0.6～0.7，取50 μL涂布平皿，1、2、3、4组滤纸片分别浸取各自茶样茶汁，28 ℃恒温培养，不间断对小滤纸片周围及平皿大肠杆菌生长情况观察。大肠杆菌培养至19 h（图3），1、2、3、4组滤纸片周围有明显透亮的抑菌圈存在，但未浸取茶汁的小滤纸片周围则无抑菌圈出现;各处理组抑菌圈大小有一定差异，其直径大小依次为：HM2>HM1发花黑毛茶>黑毛茶;测量各组所有小滤纸片抑菌圈的大小，1、2、3、4组各抑菌圈大小依次为：0.965 2±0.051 8、0.930 10±0.034 3、0.998 6±0.042 4、1.113 7±0.060 6，数据进行SPSS19.0分析及作图（图4），发现4组与1、2、3组均达到了差异极显著水平（P<0.01）;2组与3组也达到了差异极显著水平（P<0.01）。说明HM2对大肠杆菌抑制能力最强，其次是HM1、黑毛茶，发花黑毛茶抑菌能力最弱;但黑毛茶与发花黑毛茶的抑菌能力没有达到差异显著水平。由此可知，发花后导致黑茶对大肠杆菌抑菌能力稍有减弱，而添加莓茶一起发花对大肠杆菌抑制能力提高，随之莓茶添加量增加，抑菌圈也增大，说明莓茶在黑茶中的含量在一定程度内与抑菌作用呈正相关。

由图1～4可知，黑毛茶、发花黑毛茶、HM1、HM2总体上来说，对青霉、黑曲霉有助生长作用，但对大肠杆菌生长有明显抑菌作用。

3.2黑毛茶莓茶复合配比及发花后感官审评

将黑毛茶与莓茶原料先配成系列比例，进行初次感官审评，挑选口感度较好的复合配比样进行冠突散囊菌发花实验。通过对黑毛茶、发花黑毛茶、HM1、HM2的感官审评可知（表1），与未发花黑毛茶相比，发花后黑毛茶、HM1、HM2均有明显的菌花香;汤色在黑毛茶黄色明亮的基础上加深、变红变棕红，亮度有所消减;滋味也呈现明显菌花味，添加了莓茶的HM1、HM2滋味回甘，有一定收敛性;叶底色泽由黄褐转为棕褐色，HM1、HM2中的莓茶叶底与黑茶叶底颜色匹配、不突兀。

3.3黑毛茶及其莓茶复合发花产品的化学组分变化

3.3.1生物碱含量变化

比较1、2、3、4组可可碱、咖啡碱及茶碱含量变化，由表2可知，发花黑毛茶与黑毛茶对照样比较，可可碱、咖啡碱含量分别下降56.0%、4.9%。HM1、HM2与黑毛茶对照样比较，可可碱含量显著性下降（P<0.01），而发花黑毛茶与黑毛茶对照样比较，可可碱含量下降（P<0.05）;发花黑毛茶、HM1、HM2与黑毛茶比较，咖啡碱含量均显著下降（P<0.01）;4组样品以HM2可可碱、咖啡碱含量下降幅度最大，但HM1、HM2之间无显著性差异;所有样品茶碱含量HPLC未检测出。复合莓茶黑茶配比中莓茶比例仅占10%～20%，但发花后可可碱、咖啡碱含量比黑毛茶对照样下降36%～37%，由此可知，在黑毛茶发花及在此基础上配比添加少量莓茶，可显著降低生物碱含量，降低人饮茶后失眠等生物效应，并且增加产品浓强度和舒适的感觉，避免黑茶发花后味淡的弱点。

3.3.2儿茶素组分及没食子酸变化

通过HPLC方法，对各组别茶样进行儿茶素等组分分析，获知各儿茶素组分没食子酸的含量变化（表3）。

比较1、2、3、4组儿茶素组分含量变化，由表3可知，与黑毛茶相比，发花黑毛茶、HM1、HM2儿茶素总量在发花后均呈下降趋势，发花黑毛茶下降幅度最大为71.68%，而HM1、HM2中莓茶的存在，则有效地缓解了儿茶素含量的减少趋势。简单儿茶素中，仅DL-C的含量在发花之后显著上升，发花黑毛茶上升幅度最大达到361.95%;EGC、EC结果中显示，与黑毛茶相比，发花黑毛茶、HM1、HM2简单儿茶素含量显著下降，且HM2下降幅度最大，分别为80.21%、100%。酯型儿茶素中，EGCG，ECG的含量变化，与黑毛茶相比，发花黑毛茶、HM1、HM2的含量均显著下降（P<0.01），下降幅度无明显差异;但GCG含量结果发生了极为显著的变化：与黑毛茶相比，发花黑毛茶、HM1、HM2的含量分别上升了82.03%、1 927.31%、1 551.24%（P<0.01）;与发花黑毛茶相比，HM1、HM2的含量分别上升了1 013.75%、807.15%（P<0.01）。

由此得知，黑毛茶进行发花，使儿茶素含量显著降低，使其抑菌作用被抑制;而加入一定的比例的莓茶，则使黑茶的抑菌效果得到充分发挥，又能保持口感的厚度。

通过HPLC方法得到4组茶样没食子酸含量变化（表3），比较4组茶样没食子酸含量，与1组黑毛茶相比，2，3，4组发花黑毛茶、HM1、HM2没食子酸含量显著上升（图5），且HM2上升幅度最大，为462.69%，均具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。与发花黑毛茶相比，HM1无明显差异，HM2则与其差异性极显著，HM1、HM2之间差异性极显著（P<0.01，P<0.05）。表明酯型儿茶素水解使没食子酸含量增加，且莓茶促进了没食子酸含量的升高，使“金花”莓茶复合黑茶的抑菌作用增强。

4结论与讨论

综合分析，在抑菌能力上，李佳莲[20]、彭晓赟[21]等在之前已经证明冠突散囊菌与黑茶的抑菌作用，莓茶的抑菌作用在多年的研究中也得到有效地证明[4-9]。本研究中“金花”莓茶复合黑茶的抑菌实验结果及数据分析，再次验证了“金花”莓茶复合黑茶在对青霉以及大肠杆菌的抑菌作用上的良好表现，对黑曲霉的生长无明显抑制作用。但因黑曲霉极易生长繁殖，推测是样品的高浓度茶汁为黑曲霉提供了极为丰沃的生长环境，使得“金花”莓茶复合黑茶对黑曲霉的生长无明显抑制作用。

通过HPLC方法发现，“金花”莓茶复合黑茶的品质成分有着明显改变：生物碱含量显著下降，总儿茶素含量降低，没食子酸含量显著增加。生物碱含量显著下降，能降低人饮茶后失眠等生物效应，并且增加产品浓强度、舒适感，使其味更醇;发花使黑茶儿茶素总含量显著下降，但莓茶能够有效地缓解这种下降趋势，使黑茶保持其原有的抑菌能力的同时，保存其醇厚的口感，增加物质感;在内含成分的影响上，与刘武嫦[22]的研究成果一致;由本次实验结果，可以顺理推测在原材料良好的降血压、血脂、保肝等保健作用上，此次结合可能又会发挥出优秀的作用，后续的实验可以进行此方面的药理实验。

本研究中发现“金花”莓茶复合黑茶对黑曲霉不能有效抑制的结论，可能是本次实验所采用的茶汁浓度给予了黑曲霉过于丰富的生长基质，使其无法被有效抑制，可以在后续实验中对茶汁浓度进行梯度设置以寻找能有效抑制黑曲霉及青霉生长的茶汁浓度，作为后续生产过程中的依据。

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（责任编辑：郑京津）