张皓淳

(辽宁省农业发展服务中心，辽宁 沈阳 110034)

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV) 在1921 年第一次被人类检测到，发现地为肯尼亚，家猪、野猪都能感染。因为宿主的不一致性，非洲猪瘟(African swine fever，ASF)的临床症状也有所差异，家猪感染后的临床表现比较接近传统猪瘟的，都会出现呼吸窘迫、全身出血等症状，死亡率达到100%。世界动物卫生组织将ASF 纳入A 类疫病。

ASFV 是一种带有囊膜的DNA 病毒，全长170 kb～190 kb，基因组涵盖150～167 个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，可编码超过150 种蛋白，包括p54 蛋白、p30蛋白等。其中磷蛋白p30 基因（phosphoprotein p30 gene，CP204L）位于ASFV 基因组保守区，编码的p30 蛋白是ASFV 重要的毒力蛋白，具有较好的抗原性。p30 蛋白在ASFV 感染早期就已产生，且数量较多，可以导致感染猪产生中和抗体，是一种比较理想的血清学诊断以及免疫学测定的抗原[1-2]。我国于2018 年8 月开始出现非洲猪瘟疫情，现已严重影响我国养猪业的发展，因此建立快速诊断方法对确保养猪生产正常进行极为重要。

本试验成功构建了pET-32a-p30 原核表达载体，利用表达的p30 蛋白免疫蛋鸡，能够得到ASFV p30 蛋白的特异性卵黄抗体，根据测定结果发现该卵黄抗体具有良好的生物学活性，可以为今后研发用卵黄抗体检测非洲猪瘟疾病打下一个良好的基础。

1 材料

1.1 试验动物

试验所用15 羽产蛋期白来杭蛋鸡购自锦州医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂

弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma 公司，pMD-18T-p30、pET-32a 由本实验室保存，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP) 标记物购自Abcam 试剂公司。一抗为非洲猪瘟病毒阳性血清，来自国家外来动物疫病研究中心；二抗为HRP 标记羊抗猪IgG，来自Abcam 试剂公司。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactoside，IPTG) 购自生工生物工程(上海) 股份有限公司。低相对分子质量蛋白marker、禽成髓细胞血症病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)反转录试剂盒、DNA 连接试剂盒由大连宝生物公司生产。质粒小提试剂盒、DNA 纯化回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

1.3 主要仪器

超净工作台(型号为SW-CJ-IF) 购自苏州泰安空气技术有限公司，多功能酶标仪购自美国赛默飞公司，高速冷冻离心机购自日本HITACHI 公司，移液器购自德国Eppendorf公司。

2 方法

2.1 引物设计

参照已公布的ASFV 磷蛋白p30 基因的核苷酸序列(GeneBank 登录号：FR682468.1) 设计引物，上游引物序列为5’-CGGGATCCGATTTTATTTTAAATAT-3’，下游引物序列为5’-CCGCTCGAGAATGTAGGTGAGATA AAAGCTT-3’，在引物上添加酶切位点以及保护性碱基。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.2 ASFV 磷蛋白p30 基因克隆及表达质粒构建

以pMD-18T-p30 为模板对ASFV 磷蛋白p30 基因进行PCR 扩增。反应参数为：cDNA 1 μL、上下游引物(10 μmol/L)0.5 μL、2×PCR mix 10 μL、ddH2O 8 μL；PCR 反应程序为：94 ℃ 2 min；94℃ 30s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物回收后，与pET-32a 载体分别进行双酶切，酶切产物回收后，用T4 连接酶连接，构建重组质粒pET-32a-p30，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，经菌液PCR、双酶切及DNA 测序鉴定正确后，低温保存备用。

2.3 p30 抗原蛋白的制备

取少许菌至LB 培养基(Amp+，50 mg/mL)中，37 ℃过夜培养，取2 mL 新鲜菌液添加到装有200 mL LB 培养基的锥形瓶中，37 ℃，225 r/min 培养至OD 值为0.6～0.8，然后添加终浓度为1.0 mmol/L 的IPTG，进行诱导表达，时间2 h；5 000 r/min，离心10 min，弃去上清液。剩下的菌体进行纯化，并检测蛋白浓度。用Western blotting 检测p30蛋白的抗原性，纯化的p30 蛋白经转膜，封闭后，ASFV 阳性血清为一抗，HRP-羊抗猪-IgG 作为二抗，最后使用二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine，DAB)显色处理，鉴定纯化蛋白的抗原性。

2.4 动物免疫

蛋鸡随机分为3 组，分笼饲养。第一组为空白对照组，给蛋鸡注射生理盐水。第二组为阴性对照组，给蛋鸡注射免疫大肠杆菌。第三组为试验组，以胸部肌内注射的方式给蛋鸡接种抗原蛋白，剂量为0.2 mg/羽。每隔14 d免疫1 次。第一次乳化用弗氏完全佐剂；第二次和第三次乳化用弗氏不完全佐剂；结束后用弗氏不完全佐剂加强免疫。

2.5 采集血清及鸡蛋

免疫前进行翅静脉采血，强化免疫7 d、14 d 后，分别进行采血。血样在4 ℃下静置，随后分离血清，－20 ℃下保存备用。每日收集鸡蛋，同时进行标记，4 ℃下保存备用。在21 d 时，测定蛋鸡的血清IgG 效价，并单独收集这一时期的鸡蛋。

2.6 卵黄抗体的制备及纯化

鸡蛋清洁干净后，用新洁尔灭溶液消毒，再用75%酒精擦拭鸡蛋外壳，随后用紫外灯照射，晾干后基本处于无菌状态。打开蛋壳，分离蛋清，用灭菌滤纸擦净蛋黄表面残存的蛋清。用注射器针尖刺破蛋黄膜，吸取20 g 蛋黄液，约3 mL，将其保存在离心管内，随后加入3 mL PBS，振荡混匀，再加冷氯仿进行剧烈振荡，室温下静置1 h，4 000 r/min 离心20 min，提取上清液[2]。

预处理后，用纯水按10 ∶1 稀释蛋黄液，混后用0.1 mol/L 的盐酸溶液调pH 至5.0 左右，4 ℃下静置10 min，然后4 ℃离心30 min。用0.45 μm 滤膜过滤上清液，收集滤液，作为卵黄抗体组分。将上述溶液添加至硫酸铵中保存。

将上述溶液4 ℃ 10 000 r/min 离心10 min，弃上清液，加入3 mL PBS 溶解沉淀，与硫酸钠溶液混合，25 ℃ 10 000 r/min 离心15 min，弃上清液，添加去离子水进行沉淀，得到二次盐析组分。

2.7 卵黄抗体鉴定

2.7.1 间接ELISA 检测血清和卵黄抗体效价

(1)血清抗体效价。以原核表达的p30 蛋白包被，4 ℃过夜，洗涤5 次后用5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h。以倍比梯度法稀释免疫血清，按1 ∶2 500 稀释HRP 标记的二抗羊抗猪IgG，用酶标仪检测，在450 nm 处读取相对应的OD 值。

(2) 卵黄抗体效价。采用相同方式检测卵黄抗体效价，以1 ∶10 000 稀释HRP 标记的二抗兔抗鸡IgG[3]。阳性判定标准为：(样本吸光值－空白吸光值)/(阴性吸光值－空白吸光值) ＞2.1，因此可得到血清与卵黄抗体效价。

2.7.2 免疫印迹

选择相应的蛋白样本，通过SDS-PAGE分离后在硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC 膜)上进行转移，经过HRP 标记后结合二抗兔抗鸡IgG(1 ∶5 000)，进行分析。

3 结果与分析

3.1 重组质粒双酶切鉴定及抗原p30 蛋白的表达纯化

重组质粒经双酶切后，所得目的片段为606 bp(图1)，说明重组质粒pET-32a-p30构建成功。SDS-PAGE 结果表明，重组质粒pET-32a-p30 转入大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞后，经IPTG 诱导，能够实现蛋白形式表达的融合。所产生的分子质量大约是42 ku(图2)，符合预期标准。重组菌经超声裂解后，将获得的上清液与沉淀通过SDSPAGE 电泳发现，沉淀中存在较多的目的蛋白。免疫印迹显示，蛋白在纯化后可以与ASFV 阳性血清发生反应，表明重组蛋白表达正确，而且免疫原性较佳。

3.2 卵黄抗体鉴定

3.2.1 间接ELISA 检测血清和卵黄抗体效价

p30 蛋白免疫蛋鸡在免疫7 d 后能够在血清中检测出抗体。IgY 抗体免疫蛋鸡在免疫14 d 后也仍然能够检测出。35 d 后IgY 效价达到最高，随后有所回落，但是仍然能够保持稳定状态，具有检测价值。

3.2.2 免疫印迹

在IgY 抗体中，轻链的相对分子质量大约为25 000，重链约为65 000(图3)。经二次盐析后，在硝酸纤维素膜上转移纯化后的IgY，经过封闭处理后与兔抗鸡二抗结合，将会产生DAB 显色，可以分析相应的免疫印迹[4]。试验发现，对IgY 抗体进行分离提纯后生物活性较佳。

4 讨论

作为A 类疫病，ASF 一旦大面积暴发将会造成严重的损失。和传统猪瘟病毒不同，猪感染ASFV 后能够产生特异性抗体，但是ASFV 容易发生基因突变，抗体并不能很好地保护猪，因此至今尚不存在对应的疫苗。本试验选择具备抗原免疫的蛋鸡，蛋鸡出现免疫反应后，血液中的IgG 会转移到卵黄中，形成IgY。IgY具备和哺乳动物产生的IgY 不同的生物活性，特异性和稳定性较高，在免疫学研究中具有重要价值。利用IgY 进行检测具有突出优势[5]。本试验利用ASFV p30 蛋白免疫蛋鸡，分离提纯免疫蛋白，研究其生物活性，为鉴定ASF 打下基础。

兽医常用病原学检查ASFV，其中免疫荧光法对实验室操作有更高的要求，检测耗时长，难度大，且成本较高。核酸检测法存在较高的感染风险，免疫组化法在诊断上难度较大，且检测结果无法作为确诊依据。根据血清学理论，使用抗原抗体检测法能够有效规避病毒的传播，提高检测通量，因此已在免疫领域得到广泛的应用。ASFV 的主要结构蛋白为p30 蛋白，也是血清抗体最为关键的结合位点，免疫原性相对较高。p30 蛋白作为研究对象，能够为ASFV 的检测提供良好的路径。

本研究通过原核表达获得充足的p30 蛋白免疫母鸡，并得到了相应的IgY 抗体，不仅具有较高的活性，而且也有较强的特异性，表现出较高的效价。提取IgY 的方法主要采用沉淀蛋白的方法，如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀法，按照抗体的制备方式，采用与之相适应的提取方式。本研究采用了两步盐析方式能够有效提取蛋黄液中的IgY。用ELISA 和 Western blotting 检测能够确定IgY 的活性成分，取得理想的检测效果。

ASF 属于烈性传染病，受进出口贸易的影响，导致ASF 严重影响我国的养猪业。因此，通过ASFV p30 蛋白免疫蛋鸡，分离提纯免疫蛋白，研究其生物活性，用于鉴定ASF 具有重要价值。根据相关报道表明，在识别哺乳动物的抗原蛋白表位时，当其处于高度保守的状态时，如果采用禽类抗体，将具有显著效果。用IgY 抗体进行检测，具有重要的价值意义。