关朝阳，周国英，李 聪，刘君昂

（中南林业科技大学/南方人工林病虫害防控国家林业局重点实验室/森林有害生物防控湖南省重点实验室/经济林培育与保护教育部重点实验室，长沙 410004）

降香黄檀DalbergiaodoriferaT.Chen，又名降香、花梨、花梨木等，是我国海南特有种、国家二级保护植物，天然分布于岛内西南部半干旱地区，现在广东、广西、福建以及云南等地均有引种栽培，其木材在用材和药用等方面有重要经济价值[1-4]。双线卷裙夜蛾Spodopterabilinealis隶属鳞翅目，夜蛾科，其幼虫是珍贵树种降香黄檀的主要食叶害虫之一。严重发生时会大量取食叶片，严重影响降香黄檀的生长，造成其芯材累积减缓[5]。目前，主要使用化学药剂来防治双线卷裙夜蛾，不仅造成了环境的污染，而且使双线卷裙夜蛾抗药性增强，还打破了害虫与天敌间的平衡，使得双线卷裙夜蛾的为害日益严重。

球孢白僵菌寄主范围广泛，对鞘翅目、同翅目、鳞翅目以及螨类等诸多害虫均能达到满意的防治效果[6-8]。球孢白僵菌为生物防治的重要手段，能够在自然条件下通过体壁接触感染杀死害虫[9-11]，具有对环境安全、人畜无害、潜伏期长等优点，但也有杀虫效果慢、受环境影响较大等缺点。因此许多专家学者利用低用量的杀虫剂与虫生真菌混配进行害虫防治，既可使菌剂增效，又可大幅度降低化学药剂用量，减少对环境的污染[12]。Rivero-Borja等[13]研究了球孢白僵菌和金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae与乙基毒死蜱和多杀菌素混用对草地贪夜蛾SpodopterafrugiperdaJ.E.Smith幼虫的防治。结果表明，低浓度乙基毒死蜱和多杀菌素能够提高球孢白僵菌和绿僵菌对草地贪夜蛾幼虫的杀虫效果，并减少了杀虫剂的使用量，减少杀虫剂对环境的影响。吴晋华等[14]利用共毒系数法研究球孢白僵菌S8与印楝素混配对草地螟Loxostegesticticalis的防效，在菌药比为1:2时协同作用最高，共毒系数高达327.5，在田间防治中也存在显著的增效作用。杀虫剂与球孢白僵菌合理混用，既可提高杀虫效果，还可以减缓化学杀虫剂抗药性的产生。

本研究通过评价六种无公害杀虫剂对球孢白僵菌菌株HB-P-04的相容性，测定球孢白僵菌与低剂量无公害杀虫剂对双线卷裙夜蛾幼虫的联合杀虫效果，为双线卷裙夜蛾的田间合理用药及抗性治理具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

球孢白僵菌菌株 HB-P-04于 2019年 9月分离自海南省海口市澄迈林场（110°32′51″～110°34′54″ E，21°43′42″～21°44′09″ N）的僵死虫。由湖南省中南林业科技大学森林有害生物防控湖南省重点实验室保存。双线卷裙夜蛾于2020年8月在海南省澄迈县澄迈国营林场的降香黄檀人工林间捕捉，用未施药的降香黄檀嫩叶饲养，饲养条件为温度（25±1）℃，相对湿度80%，光周期14L:10D，选取健康的3～4龄双线卷裙夜蛾幼虫备用。供试杀虫剂为海南地区可购买到的常用于防治降香黄檀虫害的无公害杀虫剂，种类见表1。

表1 供试杀虫剂种类信息Table 1 Types of pesticides tested

1.2 无公害杀虫剂对菌株HB-P-04 孢子萌发、菌丝生长和产孢量的影响

将菌株HB-P-04接种于SDAY平板上培养7 d后获得新鲜的孢子，血球计数板计数，含0.05%吐温-80的无菌水配制成1.0×107孢子/mL的孢子悬浮液。六种无公害杀虫剂用无菌水稀释3种浓度梯度：常规推荐使用浓度（×1）、常规推荐使用浓度稀释5倍（×5）、常规推荐使用浓度稀释10倍（×10）。六种无公害杀虫剂处理后的球孢白僵菌分生孢子萌发率、菌落生长及产孢量的测定及计算方法参照文献[15]。

1.3 球孢白僵菌与无公害杀虫剂对双线卷裙夜蛾的联合毒力

用含0.05%的吐温-80的无菌水将苦参碱配制成5.81、11.62、23.23、58.09、116.18 mg/L，采用浸液法对双线卷裙夜蛾进行毒力测定，将供试幼虫放入配制好的药液中进行浸蘸3～5 s，迅速取出放置于经过高压灭菌的滤纸上，使其任意爬行2～3 min，待水分晾干，然后放入无菌的塑料培养盒中，并以降香黄檀嫩叶为食物。每个处理设置3组重复，每组处理20只试虫，置于培养箱内饲养，接种后每天观察记录幼虫的死亡情况，连续观察10 d。分别设置0.05%吐温-80空白对照。计算苦参碱单剂对试虫的半致死浓度LC50值。

用含0.05%的吐温-80的无菌水将球孢白僵菌配制成浓度为1×108孢子/mL的孢子悬浮液，并将孢子悬浮液分别稀释为1×107、1×106、1×105、1×104孢子/mL，采用浸液法对双线卷裙夜蛾进行毒力测定，测定方法同上。每个处理设置 3组重复，每组重复接种20只试虫，分别设置0.05%吐温-80空白对照。计算半致死浓度LC50值。

根据试验方法中测定的苦参碱单剂的LC50值，配置苦参碱的药液浓度LC50稀释液；球孢白僵菌孢子悬液浓度选定1×107孢子/mL。将苦参碱药剂与球孢白僵菌孢子悬液按体积比9:1、4:1、1:1、1:4和1:9配置母液，再分别用无菌水稀释成倍数浓度梯度。采用浸液法对双线卷裙夜蛾进行毒力测定，每个处理设置3组重复，每组重复接种20只试虫，分别设置0.05%吐温-80空白对照。计算各组药剂对试虫的半致死浓度 LC50值。通过复配剂共毒系数（co-toxicity efficient，CTC）的数值判断联合毒力效果。

1.4 球孢白僵菌与杀虫剂的使用顺序和时间对双线卷裙夜蛾协同作用的影响

配置苦参碱的药液浓度LC50稀释液；球孢白僵菌孢子悬液浓度选定1×107孢子/mL，苦参碱药剂的浓度为28.12 mg/L，球孢白僵菌孢子悬液与苦参碱药剂的用量体积比为1:4。设置两组试验，①采用浸液法对双线卷裙夜蛾进行毒力测定，先用球孢白僵菌孢子悬液处理，间隔12 h、24 h、36 h后用苦参碱药剂处理；②采用浸液法对双线卷裙夜蛾进行毒力测定，先用苦参碱药剂处理，间隔12 h、24 h、36 h后用球孢白僵菌孢子悬液处理。两组试验分步处理两种药剂的比例仍按照增效体积比配制，苦参碱处理组按照表2试验组处理方法。

表2 球孢白僵菌与苦参碱试验组合编号及处理方法Table 2 Number and treatment method of test combination of Beauveria bassiana and matrine

1.5 数据统计与分析

所有数据通过Excel 2010及SPSS 22.0软件进行数据处理分析，计算均值、标准误，并利用Ducan氏新复极差法分析各处理的差异显著性，采用Probit回归计算LT50、LC50。参考Sun等[16]方法测定共毒系数（co-toxicity co-efficient，CTC），以CTC 值判断联合毒力作用：100＜CTC＜120 表示混用剂有相加作用；≥120表示混用剂有明显增效作用；≤100表示混用剂有拮抗作用。由χ2检验球孢白僵菌与苦参碱协同的交互作用类型，各个处理对双线卷裙夜蛾的校正死亡率进行反正弦值转化。参考Huang等[17]的方法，计算公式：Me＝Ma＋Mb(1―Ma)；χ2＝[(Mab―Me)×100]2/(Me×100)。

其中，Ma和 Mb分别是苦参碱药剂和球孢白僵菌孢子悬浮液单独处理双线卷裙夜蛾的实际校正死亡率；Mab是菌药混用对双线卷裙夜蛾的实际校正死亡率；Me是菌药混用对试虫的期望死亡率；计算得出的χ2与χ2值进行比较，在χ2表格中查找df＝1对应的P值。当计算得的χ2＜P，则表示球孢白僵菌和苦参碱混用表现出拮抗作用；当计算得的χ2＞P，则表示球孢白僵菌和苦参碱混用表现出协同增效作用。

2 结果与分析

2.1 无公害杀虫剂对菌株HB-P-04 孢子萌发、菌丝生长和产孢量的影响

评估球孢白僵菌与无公害杀虫剂的生物相容性，结果如表3所示。六种无公害杀虫剂在试验中的三种浓度梯度下对球孢白僵菌的孢子萌发、菌丝生长均有程度各异的抑制作用。随着杀虫剂稀释倍数增加，杀虫剂对球孢白僵菌孢子萌发、菌丝生长的抑制率逐渐降低。在推荐使用浓度下，六种无公害杀虫剂对球孢白僵菌孢子萌发、菌丝生长的抑制率均较高。在5倍和10倍稀释浓度下，苦参碱对球孢白僵菌孢子萌发、菌丝生长的抑制率最低。六种无公害杀虫剂对白僵菌产孢量的影响结果如图1所示。在推荐使用浓度和5倍稀释浓度下，六种无公害杀虫剂对球孢白僵菌产孢量均有不同程度的抑制作用。在10倍稀释浓度下，苦参碱反而促进球孢白僵菌的产孢。综合评价菌株HB-P-04与六种无公害杀虫剂的生物相容性，苦参碱对球孢白僵菌的影响较小，即相容性最高。

表3 六种无公害杀虫剂对菌株HB-P-04孢子萌发、菌丝生长的影响Table 3 Effects of six pollution-free pesticides on spore germination and hypha growth of strain HB-P-04

图1 六种无公害杀虫剂对菌株HB-P-04产孢量的影响Fig.1 The effect of six pollution-free insecticides on the spore production of strain HB-P-04

2.2 球孢白僵菌与无公害杀虫剂对双线卷裙夜蛾的联合毒力

将球孢白僵菌与无公害杀虫剂对双线卷裙夜蛾的室内毒力测定结果进行线性回归分析，计算得出各药剂的毒力回归方程，分析结果表明，0.5%苦参碱的LC50为28.12 mg/L。低浓度的苦参碱与球孢白僵菌对双线卷裙夜蛾的联合毒力从表4可看出球孢白僵菌与0.5%苦参碱可溶液剂的混配剂在1:4、1:1、4:1和9:1体积配比下的共毒系数均大于 120，表明球孢白僵菌与苦参碱的混配剂对双线卷裙夜蛾的生物防治均有不同程度的增效作用，其中球孢白僵菌与苦参碱体积比为1:4的处理组的共毒系数最高，达到223.48，有最高的联合毒力效果，显示出了明显增效作用；球孢白僵菌与苦参碱的混配剂在1:9体积配比下的共毒系数接近120，显示出混剂有相加作用，并没有明显的增效作用。

表4 苦参碱与球孢白僵菌对双线卷裙夜蛾的联合毒力Table 4 The combined virulence of matrine and B.bassiana to S.bilinealis

2.3 球孢白僵菌与杀虫剂的使用顺序和时间对双线卷裙夜蛾的协同增效作用

球孢白僵菌与苦参碱的使用顺序和时间对双线卷裙夜蛾的协同增效作用如表5所示。其中，球孢白僵菌与苦参碱协同作用对双线卷裙夜蛾的校正死亡率显著高于单一使用球孢白僵菌和苦参碱。单一使用苦参碱9 d时校正死亡率为53.57%，单一使用球孢白僵菌9 d时校正死亡率为73.81%。组合T3在3 d、5 d、7 d时均表现为协同增效作用，组合T4在3 d、9 d时未表现协同增效作用，组合T5、T6在5 d、7 d、9 d时均未表现协同增效作用，因此组合T4、T5、T6在先使用苦参碱后再球孢白僵菌处理并不能对双线卷裙夜蛾起到协同增效作用。组合T7在3 d、5 d、7 d时均表现为协同增效作用，组合T8在3 d、5 d、7 d、9 d时均表现为协同增效作用，而T9在除3 d之外均未表现协同增效作用。组合T7、T8、T9结果表明，先使用球孢白僵菌处理，间隔12 h、24 h后使用苦参碱均表现出不同程度的协同增效作用，其中在间隔24 h时表现出显著的协同增效作用，9 d的校正死亡率为92.86%，但间隔36 h时未表现出协同增效作用。因此可选择先球孢白僵菌处理，24 h后苦参碱处理的混用方法防治双线卷裙夜蛾，以达到更好的防治效果。

表5 球孢白僵菌和苦参碱对双线卷裙夜蛾协同作用的累计致病力Table 5 Cumulative pathogenicity of the synergistic effect of B.bassiana and matrine on S.bilinealis

2.4 球孢白僵菌与苦参碱混用对双线卷裙夜蛾的杀虫效果

球孢白僵菌与苦参碱混用对双线卷裙夜蛾的杀虫效果结果如表6所示。试验显示，球孢白僵菌与苦参碱体积比为1:4混用处理的9 d累计校正死亡率显著高于球孢白僵菌单剂处理（P＜0.05）。球孢白僵菌与苦参碱体积比为1:4，先球孢白僵菌处理，24 h后苦参碱处理组的9 d累计校正死亡率显著高于球孢白僵菌单剂处理（P＜0.05）。球孢白僵菌与苦参碱体积比为1:4混用处理的LT50为4.43，先球孢白僵菌处理，24 h后苦参碱处理的LT50为3.55，表明球孢白僵菌与苦参碱混用均可有效提高球孢白僵菌的杀虫效果。

表6 球孢白僵菌与苦参碱混用对双线卷裙夜蛾的致死中时Table 6 The lethal time of the mixed use of B.bassiana and matrine on S.bilinealis

3 讨论

目前林间对双线卷裙夜蛾的防治主要以化学防治为主，大量使用化学杀虫剂会造成环境的污染，使双线卷裙夜蛾抗药性增强，还会打破害虫与天敌间的平衡。苦参碱是天然的植物源杀虫剂，具有高效、广谱、低毒等特点[18]。化学杀虫剂与虫生真菌混用不仅缓解了真菌侵染害虫较慢的特点，缩短杀虫时间，提高杀虫效率；而且减缓害虫抗性的升高，大大减少了化学污染[19]。本文在选择合理混用的杀虫剂时，选择了与球孢白僵菌相容性高的苦参碱，低浓度处理对球孢白僵菌孢子萌发、菌丝生长及产孢影响较小，相容性良好，使苦参碱和球孢白僵菌能够发挥更好的防治优势。当球孢白僵菌与苦参碱体积比为1:4时的共毒系数最高，达到223.48，有最高的联合毒力效果，显示出了显著的增效作用。在球孢白僵菌与苦参碱的使用顺序和时间对双线卷裙夜蛾协同作用影响的试验中表明，先球孢白僵菌处理，间隔24 h后苦参碱处理的混用方案表现出显著的协同增效作用，9 d的校正死亡率为92.86%。在室内毒力试验中，球孢白僵菌对双线卷裙夜蛾显示出良好的杀虫效果，以球孢白僵菌与苦参碱混用对双线卷裙夜蛾的杀虫效果更佳。同时不论是球孢白僵菌与苦参碱以体积比1:4混用，还是先球孢白僵菌处理，间隔24 h后苦参碱处理的混用方案，都能有效地缩短杀虫时间，提高杀虫效率。

理论上，杀虫剂的使用能够降低害虫的免疫力，为球孢白僵菌在虫体寄生提供条件[20-22]。在联合毒力的测定中，苦参碱与球孢白僵菌的最佳配比为体积比4:1。胡安岭等[23]研究了昆虫生长调节剂氟铃脲与球孢白僵菌防治甜菜夜蛾的最佳配比的体积比也为 4:1。但很少有研究探讨杀虫剂与虫生真菌的使用顺序和时间间隔对试虫协同作用的影响。Meyling等[24]研究了球孢白僵菌KVL03-122与拟除虫菊酯类杀虫剂高效氯氟氰菊酯在不同时间间隔和使用顺序下对黄粉虫Tenebriomolitor的杀虫效果。结果表明，先使用球孢白僵菌后使用高效氯氟氰菊酯时，仅在用药间隔大于48 h时才有协同作用。Furlong等[25]研究了球孢白僵菌与亚致死剂量吡虫啉和环丙氨嗪的杀虫剂在科罗拉多马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata(Say)幼虫上的协同作用。使用亚致死剂量的吡虫啉和一定剂量的球孢白僵菌处理马铃薯甲虫幼虫时，显示出协同作用；当先使用吡虫啉处理24 h后喷施球孢白僵菌分生孢子时，表现出协同增效作用。杀虫剂与虫生真菌同时混配应用也许不是唯一的协同增效方案，杀虫剂与虫生真菌的使用顺序和时间间隔也会影响对害虫的协同作用。因此利用低用量的杀虫剂与虫生真菌混用进行害虫防治，进而提高防治效率，是克服或缓解害虫抗药性的有效途径之一。