刘 为 尹金晶 吴慕慈 杨 宁 何静仁, 张 瑞

(1. 武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2. 武汉轻工大学硒科学与工程现代产业学院，湖北 武汉 430023)

硒是人体必需营养素之一，具有抗氧化、抗病毒、调节免疫等生理功能，与人类健康密切相关[1-3]。在自然界中，硒主要以无机硒和有机硒两种形式存在，植物、动物和微生物等可将无机硒转变为有机硒，植物中的有机硒主要以游离的硒代氨基酸和硒蛋白中结合态硒代氨基酸形式存在[4]。研究[5-6]证明，无机硒对机体的安全阈值窄，过量摄入会导致人体中毒，而有机硒毒害低、生物活性强，且比无机硒更易被人体吸收利用。由于人体无法自行合成有机硒，必须依赖外源性膳食摄入，且不同形态硒在人体内的生物学效应和生物利用率差异较大，因此寻找一种灵敏、准确和可靠的检测方法以确定食物硒化合物的形态及含量，对进一步评估富硒产品的营养价值和含硒化合物对人体健康影响具有重要意义。

目前硒形态检测的常用方法为高效液相色谱—电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)和高效液相色谱—氢化物发生—原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)[7]，其中HPLC-HG-AFS因原理简单、测试光谱干扰较少、分析时间短、成本较低等诸多优点而被广泛应用[8]。植物样品中有机硒的提取及硒形态分析的前处理过程中，酶水解法具有反应条件温和及可防止物质原始形态转变的优点，是当前被广泛应用的方法，也是硒形态测定样品前处理的关键过程[9]。目前富硒农产品及硒蛋白类营养补充剂层出不穷，总硒含量的测定、硒形态分析及富硒农产品资源的营养评价也日益增多[4]，但有关不同科属富硒农产品的有机硒代氨基酸形态比较及其在不同溶解性蛋白组分中的分布差异特点研究尚未见报道。因此，研究拟优化硒形态测定前处理和液相色谱分离分析条件，建立一种基于HPLC-HG-AFS的硒代氨基酸测定方法，分析禾谷类和十字花科富硒农产品中典型硒代氨基酸形态含量及其在不同溶解性蛋白组分中的差异化分布特点，旨在为富硒农产品不同溶解性蛋白资源进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

富硒西兰花：深圳福山生物科技有限公司；

富硒大麦苗：湖北吉田有限公司；

富硒大豆：黑龙江新三农大豆种植合作社；

富硒玉米：湖北恩施德源健康科技发展有限公司；

SeCys2、MeSeCys、SeMet标准溶液：中国计量科学研究院；

SeEt标准品：北京百灵威科技有限公司；

蛋白酶E、蛋白酶K：北京索莱宝科技有限公司；

中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

柠檬酸、盐酸、硝酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司；

甲醇：色谱纯，美国Fisher公司。

1.2 主要仪器与设备

原子荧光光谱仪：AFS-8530型，北京海光仪器有限公司；

微波消解仪：Multiwave PRO型，奥地利安东帕有限公司；

高速冷冻离心机：FC5718R型，奥豪斯仪器(美国)有限公司；

超纯水系统：Milli-Q Syhthesis型，美国Millipore公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-924385-III型，上海新苗器械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 富硒农产品前处理 将富硒西兰花、富硒大豆、富硒玉米、富硒大麦苗4种富硒农产品原料于60 ℃烘干，粉碎过80目筛。取干燥粉末，以料液比1∶10 (g/mL)加入正己烷，搅拌提取3 h，重复提取3次，脱脂后置于通风橱挥干残余正己烷，获得脱脂粉末。

1.3.2 富硒农产品各级蛋白制备 参照Osbonre[10]的方法，根据各级蛋白的不同溶解性，从富硒西兰花、富硒大豆、富硒玉米、富硒大麦苗中依次提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。

1.3.3 硒含量测定 参照GB/T 5009.93—2017。

1.3.4 标准溶液配制 分别取硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)标准液和硒代乙硫氨酸(SeEt)标准品，用超纯水分别配置成质量浓度为1.0 mg Se/mL标准储备液，混合稀释成质量浓度为5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg Se/L的标准工作液，现配现用。

1.3.5 样品前处理 称取0.1 g样品，加入3 mL一定浓度的蛋白酶溶液，振荡摇匀，迅速放入37 ℃恒温水浴振荡，酶解提取后，10 000 r/min离心20 min，过0.22 μm滤膜，备用。选用硒含量较高的富硒西兰花样品对提取硒形态的酶解条件进行优化，并按式(1)计算提取效率。

(1)

式中：

X——提取效率，%；

A1——样品中4种有机硒形态测定值总和，mg/kg；

A0——样品硒含量，mg/kg。

1.3.6 仪器条件

(1) 液相色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-Aq C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为15 mmol/L 柠檬酸+5 mmol/L 己烷磺酸钠(含3%甲醇)，流速1.0 mL/min，进样量100 μL。

(2) 氢化物发生参数：载流为10% HCl；还原剂为2.5% KBH4+0.5% NaOH；消解剂为0.15% KI+0.5% KOH；蠕动泵转速40 r/min，开启紫外灯。

(3) 原子荧光检测参数：硒空心阴极灯；灯电流80 mA；负高压380 V；载气、屏蔽气为氩气；流量分别为300，800 mL/min；原子化高度8 mm。

1.3.7 数据分析 每个样品设置3个平行组，使用SPSS 23 对试验数据进行处理，使用Origin 9.0 作图。

2 结果与分析

2.1 4种富硒农产品的硒含量

富硒西兰花总硒含量[(154.19±1.37) mg/kg]远超其他富硒玉米[(3.05±0.17) mg/kg]、富硒大豆[(2.84±0.11) mg/kg]和富硒大麦苗[(1.82±0.14) mg/kg]，根据作物的总硒含量可知，富硒大豆、富硒玉米、富硒大麦苗均为非聚硒植物(<100 mg/Se kg·DW)，而富硒西兰花为次级聚硒植物(100～1 000 mg/Se kg·DW)[11-12]。

2.2 样品前处理条件优化

2.2.1 蛋白酶的筛选 由图1可知，蛋白酶E对硒形态的提取效果最佳，提取效率可达62.6%，其次是蛋白酶K，提取效率为57.1%；其他蛋白酶的提取效率均低于50%，硒形态提取效果一般。蛋白酶E和蛋白酶K对硒的提取效率较好，与林樾等[13]的结果相符，这可能是由于蛋白酶K和蛋白酶E是活性广泛的丝氨酸蛋白酶，无特异性，具有促进酶水解的各种限制性位点和性质，可将硒蛋白分解成更小、更短的肽和氨基酸，从而获得更高提取效率[9,14]。

图1 酶种类对4种硒形态提取效果的影响

2.2.2 酶解时间的筛选 由图2可知，当酶解时间>4 h时，提取效率不再提高，随着酶解反应的进行反应体系pH会有所下降，同时长时间酶解的外力环境下SeCys2等硒代氨基酸稳定性会受到不同程度的影响，导致含量测定值有所降低[15-16]，故选择4 h为最适酶解时间。

图2 酶解时间对4种硒形态提取效果的影响

2.2.3 加酶方式的筛选 由图3可知，采用先添加蛋白酶E水浴2 h后再添加蛋白酶K水浴2 h的酶解方式提取效果最好，提取效率可达76.87%，高于单独使用蛋白酶进行酶解提取，与林樾等[13]的结论相符。故选择先添加蛋白酶E水浴2 h后再添加蛋白酶K水浴2 h的酶解方式对样品硒形态进行提取。

a. 只添加蛋白酶K b. 只添加蛋白酶E c. 先添加蛋白酶E水浴2 h后再添加蛋白酶K水浴2 h d. 先添加蛋白酶K水浴2 h后再添加蛋白酶E水浴2 h e. 同时添加蛋白酶E和蛋白酶K水浴4 h

2.2.4 蛋白酶添加量的筛选 由图4可知，随着蛋白酶添加量的增大，样品中硒形态提取效率有所提高，当蛋白酶添加量为3.0%时，硒形态的提取效率最佳，再继续增大蛋白酶用量，样品中硒形态提取效率变化不明显，故选择蛋白酶添加量为3.0%进行样品有机硒形态的提取。

图4 蛋白酶添加量对4种硒形态提取效果的影响

2.3 色谱条件优化

2.3.1 色谱柱的选择 以柠檬酸溶液作为流动相，分别选用PRP-X100阴离子交换柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和ZORBAX SB-Aq C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)进行测试。结果表明，PRP-X100阴离子交换柱只能分离除SeEt以外的3种硒代氨基酸组分，而ZORBAX SB-Aq C18反相色谱柱可以有效分离4种硒代氨基酸组分，因此选用ZORBAX SB-Aq C18柱作为液相分离色谱柱。

2.3.2 流动相条件优化

(1) 流动相的选择：在硒形态研究中，磷酸盐溶液和柠檬酸盐溶液常被用作流动相，使用ZORBAX SB-Aq C18柱，调整流动相浓度为15 mmol/L。结果显示，磷酸氢二铵溶液作为流动相时，只能分离出SeCys2、MeSeCys、SeMet 3个组分，而柠檬酸溶液作为流动相时4种硒代氨基酸均可顺利出峰，因此选择柠檬酸溶液进行进一步优化。

研究[17]表明，在硒形态分离时，向流动相中添加一定量离子对试剂可以有效改善分离效果及峰形。由图5可知，离子对试剂的加入使得4种硒形态均达到基线分离，当离子对试剂浓度增大时，各有机硒组分的出峰时间及峰形改变并不明显，综合考虑出峰情况和色谱柱耐受性，选择己烷磺酸钠添加浓度为5 mmol/L。

图5 己烷磺酸钠浓度对4种硒形态分离效果的影响

由图6可知，未添加甲醇时，SeEt组分出现双峰及拖尾现象，随着甲醇的加入，峰形得到明显改善。当甲醇添加量>3%时，各色谱峰强度及峰形变化较小，且分离度受到影响，综合分析峰形及出峰时间，选择甲醇添加量为3%。

图6 甲醇添加量对4种硒形态分离效果的影响

(2) 流动相浓度的选择：使用ZORBAX SB-Aq C18反相色谱柱时，流动相浓度变化对4种硒形态的分离效果无明显影响，同时考虑到高盐含量不利于色谱柱及仪器的保养，选择15 mmol/L柠檬酸溶液作为流动相。

(3) 流动相pH的选择：当pH>4.0时，SeCys2和MeSeCys无法实现分离；当pH为3.0～4.0时，随着pH的增大，各组分出峰时间有所提前(见图7)，特别是SeEt组分受影响明显，可以缩短分析时间，故选择流动相pH为4.0。

图7 4种硒代氨基酸混合标样的液相色谱图(100 μg Se/L)

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线与检出限 由表1可知，4种硒形态线性关系良好，R2≥0.999 3，该方法下4种硒代氨基酸检出限为0.86～2.79 μg/L。

表1 4种硒代氨基酸的线性关系和检出限

2.4.2 回收率与精密度 由表2可知，富硒西兰花、富硒大豆、富硒玉米、富硒大麦苗中各硒形态相对标准偏差值(RSD)均<5%，加标回收率分别为78.5%～104.1%，89.4%～103.7%，76.5%～106.8%，87.3%～103.5%，说明方法的准确性和重复性良好，可以满足检测需求。

表2 富硒西兰花的加标回收率†

2.5 样品分析

由表3可知，从硒代氨基酸整体来看，富硒西兰花的球蛋白和谷蛋白组分中均存在SeCys2、SeMet、MeSeCys、SeEt 4种硒代氨基酸，富硒西兰花清蛋白和醇溶蛋白组分，富硒玉米谷蛋白组分均含有除SeEt以外的其他3种硒代氨基酸，其余硒蛋白组分中则只含两种或一种硒代氨基酸。

表3 富硒农产品各级蛋白组分中4种有机硒形态含量†

由图8可知，富硒大豆、富硒玉米和富硒大麦苗不同溶解性蛋白中主要硒代氨基酸为SeMet，SeMet在此3种原料蛋白的硒代氨基酸中占比可达66%以上，其中富硒玉米除谷蛋白有SeCys2和MeSeCys检出，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白中均只检出SeMet。SeMet是富硒农产品不同溶解性蛋白中均有分布的硒代氨基酸，其普遍存在于富硒植物蛋白这一特点与SeMet代谢吸收途径密切相关。SeMet在植物中的生物合成途径与蛋氨酸(Met)十分相似，在Met的合成过程中tRNA对S和Se并无特异性识别，使得SeMet可以直接进入富硒植物蛋白质，大豆、玉米、大麦苗这类非聚硒植物蛋白质中硒代氨基酸主要以SeMet形式存积[18]。富硒大麦苗蛋白中除了SeMet，还存在着一定比例的SeCys2，但含量较少，可能与大麦苗吸收转换硒的能力有关。

图8 4种富硒农产品各级蛋白中有机硒形态占比

富硒西兰花作为十字花科植物中次级聚硒植物，其各级蛋白中硒代氨基酸含量较高。土壤中的硒被植物吸收后经过S代谢途径被还原或转化为SeCys和SeMet，这两种硒代氨基酸在蛋白质中进行非特异性结合，代替了部分Cys和Met参与其中，然而，当硒被过度积累时会致使蛋白质的折叠中断，从而引发中毒反应，为避免中毒，许多十字花科植物会通过甲基化的方式转变硒的储存形式，因此西兰花中存在较高含量的MeSeCys[11,19]。在西兰花清蛋白和谷蛋白中检出MeSeCys含量分别为21.53，16.05 mg/kg。研究[20]表明，植物中MeSeCys不进入蛋白质而直接存于植物，但此类硒代氨基酸可被提取剂提取出来，因而推测在蛋白质提取的同时，西兰花中大量存在的MeSeCys仍会被溶出，继而被检出。

除SeMet外，可直接被结合进入蛋白的SeCys2也在大豆、玉米、大麦苗3种禾谷类植物中有所分布，富硒西兰花球蛋白和谷蛋白中除SeMet、SeCys2和MeSeCys外，还分布有少量的SeEt。十字花科植物西兰花和禾谷类植物的硒形态分布之间存在一定差异，与西兰花更为复杂、多样的硒代谢途径有关，其防中毒机制也在一定程度上丰富了有机硒的存在形式。

3 结论

通过对样品前处理条件和色谱条件进行优化，建立了高效液相色谱—氢化物发生—原子荧光光谱联用测定富硒西兰花、富硒玉米、富硒大豆、富硒大麦苗中SeMet、SeCys2、MeSeCys、SeEt 4种有机硒形态的方法。结果表明，该方法操作简单、重复性好、准确性高、成本低，满足富硒农产品中多种有机硒形态检测需要。大豆、玉米、大麦苗3种禾谷类富硒农产品蛋白中硒代氨基酸主要以SeMet形式存在，而十字花科的富硒西兰花蛋白中SeCys2、SeMet和MeSeCys占比较高，且硒代氨基酸在不同蛋白组分中的赋存形式及含量也存在差异。后续可探究高有机硒蛋白组分的抗氧化活性及功能特性。