袁 婷，罗龙辉，张雪吟，刘吉平

(华南农业大学 动物科学学院/亚太地区蚕桑培训中心, 广东 广州 510642)

桑树是一种药食同源的多年生木本植物，广泛应用于医药、食品、畜牧养殖等各个行业中[1-3]。桑树病害的发生一直制约着蚕桑产业的健康稳定发展，其中，桑树青枯病作为一种毁灭性的细菌性检疫病害，严重影响了桑树的产量和质量[4]。1969年广东省顺德市首次报道了桑树青枯病的发生[5]，随后传播至广东大部分的桑树种植区。至今，桑青枯病仍在广东、广西等地的蚕桑主产区流行发生，并在全国范围内的桑园种植地多有发生报道[6-7]。桑树青枯病的病原菌为茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum，茄科雷尔氏菌的寄主范围广，能感染桑树在内的450余种植物的根或茎，根据其对不同寄主致病性差异的分类报道，侵染桑树的茄科雷尔氏菌多为5号生理小种[8-9]。由于茄科雷尔氏菌种类多，存在不同的致病变种，且致病机理复杂又危害严重，被世界各国的检疫部门列入植物生产和出口贸易的重点检疫对象[10-12]。

建立高效快速的桑树青枯病病原茄科雷尔氏菌检测技术，不仅对桑树苗木的流通和检疫提供技术支持、为桑树产业的健康稳定发展保驾护航，还对各种作物青枯病的防控有重要的参考价值。目前，有关青枯病的病原菌茄科雷尔氏菌的分子检测技术主要有各种的聚合酶链式反应(PCR)法[13-14]和环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术[15]。然而这2种检测技术在实际应用中均存在一定的局限性，如PCR法检测时间相对较长，灵敏度低，在桑树青枯病的检测中效果不明显[16]；而LAMP技术虽有检测灵敏度高、反应时间短等优点，但环境的气溶胶往往影响检测结果的可靠性或引起假阳性[17-18]。等温多自配引发扩增 (Isothermal multiple self-matching-initiated amplification，IMSA)技术是2015年马学军团队发明的一种新型核酸扩增技术[19-20]，该技术主要针对靶基因设计6条引物，并能特异性地识别7个基因位点，与LAMP和荧光定量PCR相比具有更强的特异性及更高的灵敏度，在食品安全、动物健康养殖、人畜共患病病原的检测应用中证实是可靠的[21-24]，但有关IMSA检测植物病原菌特别是桑树青枯病病原的报道较少。

本研究拟以茄科雷尔氏菌果胶裂解酶基因(Pectate lyase gene)为靶标，尝试融合IMSA引物设计策略和LAMP扩增反应的技术体系，建立一种快速高效的茄科雷尔氏菌IMSA-LAMP检测技术，并对其反应体系和实用性等进行优化，以期为桑树细菌病检测、桑树青枯病检疫和桑树种苗的流通提供新的检测技术和手段。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2020—2021年从广东、广西两地的桑园采集了疑似桑青枯病症状的茎及根共24份，如表1所示。

表1 桑树青枯病田间病样Table 1 Field samples of mulberry bacterial wilt

桑青枯病病原菌茄科雷尔氏菌菌株YZqk1、YLqk1(GDMCC No.：1.1615)、XZqk2(GDMCC No.：1.1619)、XCqk4(GDMCC No.：1.1616)、LZqk5(GDMCC No.：1.1617)、YDqk6(GDMCC No.：1.1620)和其他桑源细菌菌株：阴沟肠杆菌XCYG-001(GDMCC No.：1.1600)、克雷伯氏菌 LCKL-001(GDMCC No.：1.1602)、菠萝泛菌 LCFJ-001(GDMCC No.：1.1601)、铜绿假单胞菌 YD-001(GDMCC No.：60613)、丁香假单胞菌 ZJDX-003(GDMCC No.：61844)、多黏类芽孢杆菌 YD-002(GDMCC No.：61095)、短小杆菌 YDDX-001、芽孢杆菌YD-003，均由华南农业大学亚太地区蚕桑培训中心实验室分离鉴定，含GDMCC No.的菌种由广东省菌种保藏中心保藏。

1.2 供试菌株培养

30 ℃条件下，将茄科雷尔氏菌菌株置于TTC琼脂培养基[25]培养5 d，将非茄科雷尔氏菌菌株接种于LB琼脂培养基[25]培养2 d。

1.3 细菌、疑似桑树青枯病病样及健康桑树DNA提取

供试细菌根据Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，以下简称为“生工”]说明书提取总DNA。供试病样及健康桑树样本根据Ezup柱式植物总DNA抽提试剂盒(生工)说明书提取总DNA。DNA提取后，利用超微量分光光度计(NDlife)进行浓度测定，用TE缓冲液稀释到10 ng/μL左右，-20 ℃保存备用，作为后续检测的模板。

1.4 IMSA-LAMP引物设计与合成

IMSA-LAMP引物设计，如图1A所示，在IMSA-LAMP检测中使用了6种引物，包括2种茎引物(SteF和SteR)和2对嵌套杂交引物(2个外引物DsF和DsR和2个内引物FIT和RIT)；引物特异性识别靶基因的7个不同区域，从5′端标记为F3、F2、F1、T、R1c、R2c和 R3c；DsF 和 DsR 引物由F3和R3以及F1c和R1c序列组成，FIT和RIT引物由F2和R2以及Tc和T序列组成，SteF和SteR引物分别是R1c和F1c序列[26]。IMSA-LAMP扩增原理如图1B所示，为便于说明，DNA合成从DsF开始，FIT被设置为起始过程(DNA合成以类似方式在DsR和RIT中进行)；带箭头的水平直线代表底物延长方向，带箭头的斜线代表与目标位点退火的引物，带箭头的弧线表示2个区域的自动匹配。在该步骤中，生成了4种不同长度的基本自匹配结构(SMS-1～SMS-4)[26]。根据NCBI报道的茄科雷尔氏菌果胶裂解酶基因(WP_197360060.1)序列，利用引物在线设计软件(http://primerexplorer.jp/elamp 5.0.0/index.html)设计之后，根据引物可能存在的二聚体和相近的退火温度，调整并设计出6套IMSALAMP检测的引物组。所有引物均由擎科生物有限公司合成，引物均用HPLC法纯化，引物序列见表2。

图1 IMSA-LAMP引物设计(A)及扩增(B)示意图[26]Fig. 1 Schematic diagram of primer design (A) and amplification (B) for IMSA-LAMP [26]

表2 用于扩增茄科雷尔氏菌果胶裂解酶基因的引物序列Table 2 Primer sequences used for amplifying pectate lyase genes of Ralstonia solanacearum

1.5 IMSA-LAMP反应体系与反应条件

以提取的供试细菌、疑似桑树青枯病病样及健康桑树样本DNA为模板，对茄科雷尔氏菌果胶裂解酶基因片段进行荧光定量PCR特异性扩增。扩增体系：2× LAMP Master Mix 12.5 μL(生工)，DNA Polymerase 0.5 μL(生工)，Sterilized ddH2O 8.0 μL(生工)，5×103mmol SYTOTM9 核酸染料 1 μL(Thermo Fisher Scientific)，引物 Mix 1.0 μL(外引物、茎引物、内引物体积比为 1∶4∶8)，DNA 模板 2.0 μL，共 25.0 μL。反应程序：63 ℃ 1 min，80 ℃ 1 min；将63 ℃ 1 min作为1个循环，设计45个循环。

1.6 IMSA-LAMP引物特异性

为了验证“1.4”筛选的引物检测桑树青枯病病菌的特异性，以桑源茄科雷尔氏菌及非茄科雷尔氏菌菌株进行IMSA-LAMP引物特异性试验，以健康桑树DNA作为阴性对照、无菌水为空白对照、茄科雷尔氏菌DNA为阳性对照，反应条件同“1.5”。

1.7 IMSA-LAMP不同引物浓度比例优化

为保证茄科雷尔氏菌DNA能在IMSALAMP体系中达到最佳扩增效果，在上述“1.5”反应扩增体系基础上，对引物比例进行筛选。以10 ng/μL的茄科雷尔氏菌YZqk1 DNA为模板，以“1.6”最佳引物组为扩增引物，设置4组不同的引物浓度比例，即外引物(100 μmol/L)、茎引物(100 μmol/L)、内引物 (100 μmol/L)体积比依次为1∶4∶8、1∶2∶4、1∶1∶2、1∶8∶4，见表3。使用荧光定量PCR仪进行IMSA-LAMP扩增，根据起始扩增时间及荧光强度等选择最佳引物浓度比例。

表3 外、茎、内引物体积配比Table 3 Volume ratio of outer, stem and inner primers μL

1.8 IMSA-LAMP反应温度优化

以10 ng/μL的茄科雷尔氏菌YZqk1 DNA为模板，在 61.5、62.0、62.5、63.0、63.5、64.0、64.5和65.0 ℃ 8个反应温度下，通过荧光定量PCR仪进行IMSA-LAMP扩增，反应体系见“1.5”。通过比较不同反应温度的荧光扩增曲线，获得最佳反应温度。

1.9 IMSA-LAMP检测法与PCR法的灵敏度对比

将茄科雷尔氏菌YZqk1纯培养后置于25 mL LB肉汤中扩增培养，于28 ℃条件下培养48 h，用稀释涂布计数方法将菌液浓度稀释成1×106CFU/mL，取1 mL于离心机中12 000 r/min离心4 min，取沉淀，根据Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取总DNA。利用超微量分光光度计进行浓度测定，按10倍稀释法用TE缓冲液将DNA梯度稀释7次，具体计算公式：稀释后DNA浓度=稀释前DNA浓度÷10稀释次数，将每个梯度作为模板进行IMSA-LAMP检测，反应体系见“1.5”。选择优化后的引物、引物浓度比例及反应温度，根据荧光扩增曲线判定检测结果；同时，采用Primer Premier 5.0软件对茄科雷尔氏菌果胶裂解酶基因设计1对PCR检测引物：PL-F(AGCTTGCTCGCTTTGAGCTGCTGCAAGACC)/PL-R(TGATCGCCCGAACAACCATTTCCAGA CGCC)，拟扩增的目的片段长度为135 bp，并利用该引物对模板进行PCR检测，反应体系为2× Taq PCR Master Mix 12.5 μL(生工)，10 μmol/L 引物 PLF、PL-R 各 1 μL，DNA 模板 2 μL，Sterilized ddH2O补足至25 μL；扩增条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性 30 s、55 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸30 s，30个循环；72 ℃ 最终延伸 8 min，于4 ℃ 保存。PCR扩增产物取5 μL经12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.10 IMSA-LAMP检测方法的验证

将广东、广西地区收集的24份疑似桑树青枯病病样(表1)提取DNA后，进行IMSA-LAMP检测，并取1份健康桑树样本为阴性对照、茄科雷尔氏菌YZqk1 DNA为阳性对照。反应体系见“1.5”，其中引物、引物浓度比例及反应温度均选择优化后的结果，并通过荧光扩增曲线进行判读；同时利用“1.9”的PCR反应体系和参数进行同步平行检测。

2 结果与分析

2.1 IMSA-LAMP引物筛选

将本研究设计的6组引物(表2)进行IMSALAMP检测，检测结果如图2所示。引物组1～6均出现了扩增曲线，引物组6于反应20 min时最先出现上升趋势，35 min后反应进入平缓期；而其他引物组均在反应25 min后才出现扩增。因此，选择引物组6作为IMSA-LAMP法最佳引物组；最佳引物组6的6条引物结合位置及7个特异识别位点，如图3所示。

图2 IMSA-LAMP 6组引物对茄科雷尔氏菌的检测结果Fig. 2 Detection results of Ralstonia solanacearum under six primer groups of IMSA-LAMP

图3 IMSA-LAMP引物组6的6条检测引物的位置及7个特异识别位点Fig. 3 Locations of six primers of primer group 6 and their seven specific recognition sites in IMSA-LAMP

2.2 IMSA-LAMP引物特异性试验

利用IMSA-LAMP对6株茄科雷尔氏菌及8株非茄科雷尔氏菌DNA进行检测，结果如图4所示。6株茄科雷尔氏菌(YZqk1、YLqk1、XZqk2、XCqk4、LZqk5、YDqk6)均在 45 min内出现了“S”扩增曲线(图4：曲线1～6)。其他8株非茄科雷尔氏菌、无菌水及健康桑树DNA均未出现扩增曲线 (图4：曲线 7～17)。表明，IMSA-LAMP检测方法筛选的引物能有效地检测茄科雷尔氏菌。

图4 茄科雷尔氏菌IMSA-LAMP特异性检测结果Fig. 4 Specific detection results of IMSA-LAMP forRalstonia solanacearum

2.3 IMSA-LAMP 引物浓度比例优化

设置外、茎、内引物浓度比例为 1∶4∶8、1∶2∶4、1∶1∶2、1∶8∶4，以 10 ng/μL 的茄科雷尔氏菌 YZqk1 DNA为模板进行IMSA-LAMP扩增，扩增温度为63 ℃，反应时间为45 min，结果如图5所示。4种不同引物浓度比例均出现了“S”曲线，当外、茎、内引物浓度比例为1∶4∶8时，起始扩增时间最短，为12 min，25 min到达扩增的平缓期；当外、茎、内引物浓度比例为1∶8∶4时，起始扩增时间为14 min，30 min达平缓期；当外、茎、内引物浓度比例为1∶2∶4 时，起始扩增时间为 23 min，35 min 达到平缓期；当外、茎、内引物浓度比例为1∶1∶2时，起始扩增时间为25 min，45 min内未出现平缓期。最终可确定最佳外、茎、内引物比例为1∶4∶8。

图5 不同外、茎、内引物浓度比例下茄科雷尔氏菌IMSA-LAMP检测结果Fig. 5 IMSA-LAMP detection results of Ralstonia solanacearum under different concentration ratios of outer, stem and inner primers

2.4 IMSA-LAMP反应温度优化

根据最佳引物比例进行IMSA-LAMP反应温度筛选，设置温度梯度为 61.5、62.0、62.5、63.0、63.5、64.0、64.5及 65.0 ℃，结果如图6所示。在61.5～65.0 ℃时，均有扩增曲线。在64.5 ℃时，起始扩增时间最短，为13 min，于24 min到达扩增的平缓期；在65.0 ℃时，在14 min曲线开始扩增，于25 min达到扩增平缓期；在61.5～64.0 ℃时，均在反应15 min后开始扩增，于30 min后达到扩增平缓期。故选择64.5 ℃作为最佳反应温度。

图6 不同反应温度茄科雷尔氏菌IMSA-LAMP检测结果Fig. 6 Detection results of IMSA-LAMP for Ralstonia solanacearum at different reaction temperatures

2.5 IMSA-LAMP法的灵敏度

茄科雷尔氏菌YZqk1纯培养后，取1 mL 1×106CFU/mL的菌悬液，根据Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取总DNA，并利用超微量分光光度计进行浓度测定，其DNA质量浓度为2 ng/μL，10倍浓度梯度稀释7次，DNA质量浓度为 2 ng/μL～200 ag/μL，对应菌为 1×106～1×10-2CFU/mL，将每个梯度作为模板进行IMSALAMP检测，并利用PCR进行平行检测作为对照。IMSA-LAMP检测结果如图7所示，茄科雷尔氏菌YZqk1 DNA 质量浓度为 2 ng/μL～200 fg/μL(对应菌为 1×106～1×102CFU/mL)，均出现了扩增曲线；而DNA 质量浓度在 20 fg/μL～200 ag/μL(对应菌为1×10～1×10-2CFU/mL)未出现扩增曲线。因此，IMSA-LAMP对茄科雷尔氏菌最低DNA检测质量浓度为200 fg/μL，对应菌为1×102CFU/mL。另外，PCR检测到的桑树茄科雷尔氏菌YZqk1最低DNA质量浓度为 20 pg/μL，对应菌为 1×104CFU/mL(图8)。IMSA-LAMP检测桑树茄科雷尔氏菌具有良好的灵敏度，是PCR的100倍。

图7 IMSA-LAMP对茄科雷尔氏菌灵敏度的检测结果Fig. 7 Sensitivity test results of IMSA-LAMP for Ralstonia solanacearum

图8 PCR对茄科雷尔氏菌灵敏度检测结果Fig. 8 Sensitivity test results of PCR for Ralstonia solanacearum

2.6 IMSA-LAMP法对生产样本的检测

将收集的24份疑似桑树青枯病病样提取DNA后，利用IMSA-LAMP法与PCR法进行试验，评估2种检验方法的检测结果。IMSALAMP检测结果如图9所示，收集的疑似桑树青枯菌病样中，有21份样本出现了“S”扩增曲线(曲线2～22)，广西壮族自治区环江市及忻城市3份疑似桑树青枯病病样未出现扩增现象(曲线23～25)，检出率为87.5%。同步进行的PCR法，其中9份样品为阳性，15份样品为阴性(图10)，检出率为37.5%，9份PCR检测阳性的样本在IMSALAMP法检测结果中也为阳性，说明2种方法有一定的重复性，但IMSA-LAMP法的检出率明显高于PCR。

图9 IMSA-LAMP对不同地区疑似桑树青枯病病样的检测结果Fig. 9 Detection results of suspected mulberry bacterial wilt samples from different districts by IMSALAMP

图10 PCR对不同地区疑似桑树青枯病病样的检测结果Fig. 10 Detection results of suspected mulberry bacterial wilt samples from different districts by PCR

3 讨论与结论

桑树青枯病作为一种毁灭性的细菌性病害，被国家列为重点检疫对象[27]。建立一种桑树茄科雷尔氏菌快速有效的检测方法，对预防桑树青枯病的发生和扩散具有重要的意义。桑树青枯病病原检测方法分为传统分离技术及分子检测技术。传统分离技术主要是通过病样组织分离病原菌的方式分离出桑树茄科雷尔氏菌，但操作繁琐，分离时间长，结果受人为影响大；随着分子检测技术的快速发展，核酸检测技术被广泛应用于医疗诊断、动植物安全生产、食品安全及动植物检疫等检测中，大大提高检测效率[28-30]。其中，LAMP是常见的核酸检测技术，本研究前期将LAMP技术应用于蚕、桑病害的检测研究，能有效检测出蚕桑病毒、细菌及真菌等病原物[31-33]。而IMSA技术的优点在于引物结合位点多，相较于LAMP技术拥有更高的灵敏度及特异性。Chen等[34]应用IMSA法对牛奶样品中金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus进行检测，灵敏度比LAMP方法高10倍；Liu等[35]对人畜共患病病原肠毒素大肠埃希菌(EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC)进行了IMSA的检测应用研究，相比于荧光定量PCR、LAMP、交叉引物等温扩增技术具有更高的灵敏度。同样地，本研究将LAMP反应体系与IMSA引物设计原理相结合应用于桑树青枯病的茄科雷尔氏菌检测，试验结果显示，IMSALAMP检测技术明显优于PCR的检测结果，本方法节约时间，且结果准确可靠。

果胶酶是一类分解果胶物质的酶的总称，在细菌生长和繁殖代谢过程中都能合成，而果胶裂解酶基因在青枯菌侵染植物过程中发挥了重要作用[36-37]。本研究在以NCBI登录的茄科雷尔氏菌基因组分析的基础上，以茄科雷尔氏菌果胶裂解酶基因(WP_197360060.1)序列为靶基因序列，进行了引物设计与筛选，经试验结果比较确定引物组6为最终的检测引物组。通过对茄科雷尔氏菌及桑源其他细菌的进行IMSA-LAMP检测，发现仅有茄科雷尔氏菌DNA样本出现扩增曲线，表明本研究建立的IMSA-LAMP检测技术特异性明显。对反应温度及引物比例进行优化，结果表明外、茎、内引物浓度比例为1∶4∶8，恒温64.5 ℃的荧光定量PCR仪在45 min内可完成检测，该方法比常规PCR方法快60 min以上，反应结果可通过荧光扩增曲线出现的先后进行快速判定，本研究建立的IMSA-LAMP法检测茄科雷尔氏菌DNA最低质量浓度达200 fg/μL，对应的菌为1×102CFU/mL，比Okiro等[38]与李信申等[39]报道的青枯病LAMP检测方法的灵敏度高10倍左右，是常规PCR检测法灵敏度的100倍，同样的结果在Gou等[40]使用IMSA检测猪圆环病毒PCV3的应用中得到佐证。

在对采自田间的24份疑似桑树青枯病样本检测中，IMSA-LAMP检测出21份样本，3份样本未检测出桑茄科雷尔氏菌；同时利用PCR法对24份病样进行平行检测，PCR仅检测出9份，这9份样本也同时印证了IMSA-LAMP的检测结果。对于其他IMSA-LAMP检测出而PCR未能检测出的阳性样本，我们分析有2种原因，一是说明IMSALAMP检测方法更加灵敏，这个推测已经在本研究纯茄科雷尔氏菌模板检测中得到验证；二是说明导致桑树青枯和枯萎症状的病原菌种类很多，本研究课题组已经相继在桑树枯萎的病样中分离出阴沟肠杆菌[25,41]、菠萝泛菌[42]及克雷伯氏菌[43]。而阴沟肠杆菌、菠萝泛菌及克雷伯氏菌作为机会性植物致病病原菌，在生产中导致植物枯萎的机理仍有待深入研究。综上，本研究建立的茄科雷尔氏菌的IMSA-LAMP检测方法准确可靠，可用于大批量桑树青枯病的快速分子诊断，为桑树细菌病检测和防疫提供了新技术支持。

致谢：试验过程中得到华南农业大学动物科学学院硕士研究生孟芳、王亚琴等的帮助，LAMP检测试剂得到广州双螺旋基因技术有限公司张璜博士与林梦蝶实验员的大力支持。