兰淑慧，温晓蕾,3，冯丽娜，霍佳欢何新月，孙伟明*，齐慧霞*

(1 板栗产业技术教育部工程研究中心，河北 秦皇岛，066004；2 河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北省特色园艺种质挖掘与创新利用重点实验室；3 河北农业大学植物保护学院)

随着板栗(CastaneamollissimaBlume)产量的提高，板栗贮藏期的病害逐年加重[1]。其中，栗实腐烂病危害日渐凸显，果实腐烂率最高达到40%～50%[2]，严重威胁着板栗产业的发展。关于栗实贮藏期腐烂病发生原因的研究较多，普遍认为是由致病微生物侵染引起，常见的致腐微生物有链格孢属(Alternariaalternata)、聚端孢属(Trichotheciumsp.)、壳梭孢属(Fusicoccumsp.)、小穴壳属(Dothiorellasp. )、丝核菌属(Rhizoctoniasp.)、青霉菌属(Penicilliumsp.)、镰孢菌属(Fusariumsp.)等[3～6]。其中，青霉菌属广泛分布于我国南北各产区腐烂栗实中[6]，小刺青霉、扩展青霉等均已报道能够侵染板栗果实[7，8]，但关于草酸青霉致病力的研究相对较少，相关报道主要围绕草酸青霉在纤维素降解、发酵生产、生物防治等方面的应用效果而展开[9，10]。笔者对引起栗果腐烂的草酸青霉菌的最适生长条件进行了室内试验，以期明确环境因子对菌丝生长及产孢的影响，为板栗采后贮藏及相关病害防治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2019～2020年在河北科技师范学院植物保护实验室进行。

栗果草酸青霉(Penicilliumoxalate)由河北科技师范学院植物保护实验室提供。

PDA培养基：马铃薯200 g·L-1,葡萄糖20 g·L-1,琼脂20 g·L-1,自然pH，蒸馏水1 000 mL。

察氏培养基：NaNO33 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，FeSO40.01 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，琼脂20 g·L-1，蒸馏水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1不同培养基对菌丝生长和产孢的影响 选用燕麦马铃薯培养基[11]、绿豆培养基[12]、玉米汁培养基[13]、板栗培养基[14]、胡萝卜培养基[15]、肉汁胨培养基[16]、沙堡弱培养基[17]共7种，即7个处理。用5 mm的打孔器从菌落边缘取菌饼，将菌饼放置于培平板的中央位置，做好标记，每个处理3次重复，置于25 ℃恒温全黑暗培养箱中培养。用十字交叉法连续测定10 d菌落直径。同样方法培养7 d后，使用血球计数板在显微镜下测定菌落产孢的情况。

1.2.2不同温度对菌丝生长和产孢的影响 将直径5 mm的菌饼接种于PDA培养基中，设置温度从5 ℃开始，每5 ℃为一个温度梯度，35 ℃为试验终止温度，共计7个温度梯度，每个处理3次重复。培养及测定方法同1.2.1。

1.2.3不同光照对菌丝生长和产孢的影响 将直径5 mm的菌饼接种于PDA培养基，将培养箱分别设置全光照、全黑暗和光暗交替共3个处理，25 ℃恒温培养，每个处理3次重复。菌落直径的测量和产孢量的测定方法同1.2.1。

1.2.4不同pH对菌丝生长和产孢的影响 用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH将PDA培养基的pH分别调节至5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0和11.0共计7个处理，将直径5 mm的菌饼接种于PDA培养基中，每个处理3次重复，培养及测定方法同1.2.1。

1.2.5不同氮源对菌丝生长和产孢的影响 以察氏培养基为基础，分别以相同含氮量的NH4Cl,牛肉膏，(NH4)2SO4，蛋白胨，酵母浸粉和KNO3置换其中的NaNO3制成7种不同的培养基，接种直径为5 mm的菌种，每个处理3次重复，培养及测定方法同1.2.1。

1.2.6不同碳源对菌丝生长和产孢的影响 以察氏培养基为基础培养基，分别以相同含碳量的麦芽糖、果糖、乳糖、木糖醇、葡萄糖、可溶性淀粉置换其中的蔗糖，制成7种不同的培养基，接种直径为5 mm的菌种，每个处理3次重复，培养及测定方法同1.2.1。

1.2.7通气状况对菌丝干质量的影响 以PDA液体培养基为基础培养基，将纯化后的菌种用直径5 mm的打孔器在菌落的边缘打成菌饼在超净工作台中移入250 mL的锥形瓶中，每个锥形瓶分装100 mL培养基。摇床分别设置为连续震荡、完全静止、间歇震荡(12 h震荡+12 h静止)共计3个处理，每个处理3次重复，培养5 d后用烘干箱烘干至恒质量，测定菌丝干质量。

表1 培养基对草酸青霉菌菌丝生长和产孢的影响

2 结果与分析

2.1 不同培养基对菌丝生长和产孢的影响

栗果草酸青霉菌在7种培养基上均可生长和产孢(表1)，在燕麦马铃薯培养基上菌丝生长最快且产孢最多，10 d菌落直径为8.50 cm(图1)，7 d产孢量达到了4.93×107个/皿；板栗培养基及胡萝卜培养基对菌丝生长的影响无明显差异；胡萝卜培养基及沙堡弱培养基对产孢量的影响无明显差异；菌丝在沙堡弱培养基中生长缓慢，平均菌落直径为3.45 cm，在板栗培养基上的产孢数量最少，为0.4×107个/皿。

注：A，板栗培养基； B，胡萝卜培养基； C，绿豆培养基； D，肉汁胨培养基； E，沙堡弱培养基； F，燕麦+马铃薯培养基； G，玉米汁培养基图1 不同培养基对草酸青霉菌菌丝生长的影响

2.2 温度对菌丝生长和产孢的影响

栗果草酸青霉菌在5～35 ℃均可生长(表2)。30 ℃时板栗草酸青霉菌菌丝生长最快产孢量最多，10 d菌落直径为4.28 cm，7 d时的产孢量为3.03×107个/皿；产孢量在25，30 ℃培养时无明显差异，在20，35 ℃培养时产孢量无明显差异；菌丝在5 ℃时菌落生长最慢，10 d菌落直径为0.97 cm，7 d产孢量最少，为0.40×107个/皿。

2.3 光照对菌丝生长和产孢的影响

栗果草酸青霉菌在3种光照条件下均可生长和产孢(表3)。在全黑暗条件有利于菌丝生长及产孢，10 d菌落直径达到了3.0 cm(图2)，7 d时产孢量5.50×107个/皿；菌丝在全光照条件下生长最慢，光暗交替时产孢最少；菌丝生长及产孢量在各处理间均存在显著差异。

2.4 pH对菌丝生长和产孢的影响

栗果草酸青霉菌在pH 5.0～11.0时均可生长产孢(表4)。菌丝生长的最适pH为7.0，10 d时菌落直径为5.98 cm(图3)；最适产孢的pH为8.0，7 d时产孢量为3.83×107个/皿；菌丝在pH为8.0和9.0的培养基上生长时无显著差异；pH为5.0，9.0的培养基对产孢量的影响无显著差异；pH为11.0时不利于菌丝生长及产孢。

表3 光照对草酸青霉菌菌丝生长和产孢的影响

注：A，全黑暗；B，光暗交替；C，全光照图2 光照对草酸青霉菌菌丝生长的影响

表2 温度对草酸青霉菌菌丝生长和产孢的影响

表4 pH对草酸青霉菌菌丝生长和产孢的影响

注：A，pH 5.0; B，pH 6.0; C，pH 7.0; D，pH 8.0; E，pH 9.0; F，pH 10.0; G，pH 11.0图3 pH对草酸青霉菌丝生长的影响

2.5 不同氮源对菌丝生长和产孢的影响

表5 不同氮源对草酸青霉菌菌丝生长和产孢的影响

在7种氮源中，板栗草酸青霉对牛肉膏及酵母浸粉的利用率最高(表5)，以牛肉膏为基础氮源的培养基最适宜菌丝生长，10 d时菌落直径为8.50 cm(图4)；以酵母浸粉为基础氮源的培养基最适宜产孢，7 d时的产孢量为2.30×107个/皿；菌丝在以NH4Cl和(NH4)2SO4为氮源的培养基上生长情况无显著差异；在牛肉膏及蛋白胨为氮源的两培养基上的产孢量无显著差异；7种氮源中，NH4Cl为氮源最不利于菌丝生长，(NH4)2SO4为氮源最不利于产孢。

注：A，蛋白胨；B，酵母浸粉；C，(NH4)2SO4；D，NH4Cl；E，牛肉膏；F，KNO3；G，NaNO3图4 不同氮源对草酸青霉菌菌丝生长的影响

表6 不同碳源对草酸青霉菌菌丝生长和产孢的影响

2.6 不同碳源对菌丝生长和产孢的影响

栗果草酸青霉菌在7种不同碳源的培养基上均可生长产孢(表6)。以可溶性淀粉为基础碳源的培养基最适宜菌丝生长且产孢量最多，10 d时菌落直径为6.15 cm(图5)，7 d时产孢量为3.35×107个/皿；以乳糖为基础碳源的培养基最不利于菌丝生长；以果糖为基础碳源的培养基产孢量最少。

注：A，可溶性淀粉;B，麦芽糖;C，果糖;D，木糖醇;E，乳糖;F，蔗糖;G，葡萄糖图5 不同碳源对草酸青霉菌菌丝生长的影响

图6 各处理菌丝干质量5%显著水平差异分析

2.7 通气状况对菌丝干质量的影响

不同通气状况对栗果草酸青霉菌菌丝干质量影响较大，在间歇震荡下菌丝干质量最大，为0.35 g；连续震荡下菌丝干质量次之；完全静止下菌丝干质量为最低值0.13 g(图6)。

3 结论与讨论

本次试验结合菌丝生长量及产孢量2个标准来衡量草酸青霉菌适宜的培养条件。试验结果表明：板栗草酸青霉菌菌丝生长及产孢最适宜的培养基为燕麦马铃薯培养基；培养温度为30 ℃时最有利于菌丝生长及产孢，与杜奕君等[18]得出的草酸青霉最适宜的产孢温度为30 ℃的结果一致；全黑暗时最有利于菌丝生长及产孢，说明黑暗刺激有利于草酸青霉菌丝生长及产孢；12 h震荡+12 h静止循环培养条件最有利于草酸青霉菌丝生长，培养5 d后菌落干质量达0.35 g；最适宜草酸青霉菌菌丝生长的pH为7.0，与王俊凤等[7]所得出的小刺青霉菌最适宜pH为7的结论一致，说明草酸青霉及小刺青霉对酸碱环境要求一致。

氮源对草酸青霉菌菌丝生长影响较大，最有利于菌丝生长的氮源为牛肉膏，与郜海燕等[19]及丁仁惠等[20]有利于波兰青霉、扩展青霉、指状青霉及意大利青霉菌丝生长的氮源为蛋白胨的结论有所不同；以可溶性淀粉为基础碳源的培养基同时适合草酸青霉菌菌丝生长及产孢，与郜海燕等[19]最适合扩展青霉菌丝生长的碳源为可溶性淀粉的结论一致，说明扩展青霉与草酸青霉对碳源的要求一致。与王俊凤等[7]所得出最适宜菌丝生长和产孢的碳源分别为可溶性淀粉和甘露醇的结论有所不同。本次研究明确了板栗草酸青霉菌对环境和营养条件的需求，但其防控技术还需进一步研究。