李佳淇，吴 真，张旭敏

(1. 复旦大学 生物化学与分子生物学系，上海 200438； 2. 复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海 200438)

在衰老过程中，生物体会经历多种多样的结构与功能的变化，主要包括运动活动减少、整体代谢率和认知功能降低、消化功能受损和DNA损伤增加等[1]。延缓这些变化在衰老相关研究中至关重要，可以为延长人类的寿命提供理论基础。秀丽隐杆线虫(下面简称线虫)是生命科学领域和医学研究中重要的模式生物之一，生命周期较短、易饲养且繁殖快，并且与人类基因的同源性达到80%，衰老相关的信号通路也都在线虫中实现了系统的研究，因此，它是研究衰老的一个重要模型。对细胞中的所有蛋白质进行表征，包括蛋白质在任何时期的表达、功能、结构、修饰和相互作用是蛋白质组学的重要内容[2]。借助蛋白质组学手段，可以系统地对线虫进行大规模研究，这对于衰老相关研究有重要意义。Walther等[3]通过定量蛋白质组学研究发现，在线虫的长寿突变体中，分子伴侣相关的蛋白质聚集增加，说明衰老过程中发生异常蛋白质隔绝以维持蛋白质稳态。Narayan等[4]采用SILAC(Stable-Isotope Labelling by Amino Acids in cell culture)方法进行线虫衰老过程中的蛋白质组学研究，比较不同时期的蛋白质丰度变化，发现了多个显著变化的代谢过程，验证了在衰老过程中受到损害的过氧化物酶体的运输过程。

线虫的寿命能够被温度显著影响[5]，在20 ℃下培养，线虫平均生存21天，在25 ℃下培养平均寿命可减少10天[6]。蛋白质磷酸化是细胞内广泛分布的蛋白质翻译后修饰，对于蛋白质行驶功能十分重要[7-8]，在调节高温环境下线虫晚期生命活动中也起到重要作用[9-10]。常温和高温下的线虫的衰老机制尚不清楚，本课题组前期的研究表明，线虫在正常温度(20 ℃)和高温(25 ℃)下的衰老过程中，激酶CK2，MAPK和CAMK2也许起到重要作用，并且验证了磷酸化蛋白GTBP-1能够在这两个温度条件下调节线虫寿命[9]。为了获得更多的线虫衰老过程中的磷酸化组学信息，我们尝试使用基于DIA(Data Independent Acquisition)的非标记定量方法[11]，对常温和高温培养条件下线虫衰老过程中的磷酸化组学变化进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

N2线虫购买于CGC(Caenorhabditis Genetics Center)官网，Amicon Ultra-4(30-kDa cutoff)Filter来自Merck-Millipore(Bedford, MA， USA)，TiO2购于GL Sciences(Tokyo, Japan)，乳酸购于Sigma-Aldrich(St.Louis, MO, USA)。

1.2 样品预处理

收集使用NGM(Nematode Growth Medium)固体培养基培养的线虫[9]，清洗3次后超声提取蛋白质。使用FASP(Filter Aided Proteome Preparation)方法[12]，胰酶酶切蛋白质产生肽段。采用基于TiO2的添加乳酸试剂的方法富集磷酸化肽段[13]，分成两部分，一部分用于数据依赖性采集(Data Dependent Acquisition, DDA)模式建库，一部分用于数据非依赖型采集(Data Independent Acquisition, DIA)搜库。

1.3 DDA样品的预分离

将各个样品中酶切后肽段各取90 μg混合后使用碱性反相色谱预分离。使用的色谱柱是Gemini-NX C18反相色谱柱(内径4.6 mm，柱长250 mm，粒径3 μm)，色谱设备是Thermo Fisher Scientific的Ultimate 3000系列。

液相色谱流动相A液为10 mmol/L碳酸氢铵，B液为10 mmol/L碳酸氢铵，80%乙腈。使用40 min梯度进行色谱分离，分别收集每分钟的流出液，正交法混为10个样品，将混好的样品分装冻干后保存在-80 ℃等待后续分析。

1.4 质谱分析

质谱仪采用搭载了EASY-nLC 1200液相系统的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪。样品分析使用单柱系统，为实验室填装的C18色谱柱(内径75 μm×柱长25 cm，Reprosil-Pur 120 C18-AQ填料)。流动相A为水，流动相B为乙腈。洗脱梯度为90 min: 0～3 min，2%～5%缓冲液B，200 μL/min；3～68 min，5%～40%缓冲液B，200 μL/min；68～78 min，40%～60%缓冲液B，200 μL/min；78～80 min，60%～100%缓冲液B，200 μL/min；80～90 min，保持100%缓冲液B，200 μL/min。

用于建库样品的质谱分析是数据依赖型采集(DDA)，一级的分辨率是60 k，二级是30 k，循环时间是3 s，采用的碎裂方式是HCD(Higher Energy Collisional Dissociation)。实验组样品采用数据非依赖型采集(DIA)。一级的分辨率是60 k，二级的分辨率是15 k。一个分析中设置了4个一级全扫描，每个全扫描后设置了15个二级扫描。设置了可变窗口。

1.5 DDA数据分析

用于建库的DDA数据原始文件导入Proteome Discoverer(2.4版，Thermo Fisher Scientific)中的Mascot服务器(2.7版，Matrix Science, London, U.K.)[14]。从Uniprot上下载线虫数据库(20200321，26 747个序列)。数据搜索参数为: 酶设置为Trypsin/P；最高2个漏切位点；一级质谱母离子偏差为10×10-6，二级质谱子离子偏差为0.05 Da；半胱氨酸残基上的丙酮酰胺化设置成固定参数；甲硫氨酸氧化，蛋白质N端乙酰化，苏氨酸/丝氨酸/酪氨酸磷酸化设置成可变修饰。使用ptmRS模块对磷酸化位点进行打分，筛选磷酸化位点可能性大于等于0.75的肽段匹配图谱(Peptide-Spectrum Matches, PSM)，然后导入Skyline建立谱图库。

1.6 DIA数据分析

DIA数据的分析在Skyline软件中完成，参数设置如下: 在肽段设置中，Trypsin作为蛋白酶；最多允许两个错切位点；IRT(11条)作为保留时间预测；时间窗口是2 min；谱图库为Mascot搜索的DDA质谱结果创建；修饰的选择与DDA搜库中的相同；最大可变修饰是6。在离子对的设置中，母离子的电荷数为2，3，4，5和6；离子电荷数是1和2；离子类型包括b，y，p；子离子选择设置成从离子3到最后一个离子-1；0.02质荷比作为离子匹配耐受性；仪器最大质荷比为2 000，最小质荷比为300。对于Skyline导出的数据也进行进一步筛选: 只保留precursor离子；删除鉴定到多种漏切位点的肽段；删除3组重复中两组以上没有鉴定信息的肽段；删除鉴定到的带有氧化或乙酰化修饰的肽段。磷酸化肽段和蛋白鉴定结果、差异表达结果以及所有相关原始数据上传到iProX数据库，ID为IPX0003177000。

2 结果与讨论

2.1 磷酸化蛋白质组学分析流程

收集在20 ℃和25 ℃培养条件下第1天(青年)、第5天(中年)、第10天(老年)线虫成虫样品，进行了磷酸化蛋白质组学分析，本次实验采用了3个生物学重复，具体分析流程见图1。不同线虫样品收集后分成两部分，一部分用于DIA搜库，磷酸化富集后质谱分析，另一部分用于DDA建库，预分后磷酸化富集然后质谱分析。两个部分的数据导入Proteome Discoverer(2.4版本)搜库，用于建库的数据选取位点可能性打分，得分大于等于0.75的磷酸化肽段导入Skyline建库，然后导入另一部分数据进行DIA搜库。Skyline导出的数据去冗余后导入到图中所示的生物信息学软件中分析。

图1 线虫衰老过程中磷酸化组学分析流程Fig.1 The workflow of phosphoproteomic study on C.elegans during aging process

2.2 磷酸化蛋白质组的定性与定量分析

共6 624条非冗余的磷酸化肽段被定量到，这些肽段含有6 910个磷酸化位点，对应2 997个磷酸化蛋白质。对于磷酸化肽段的位点分析，6 077条(91.74%)磷酸化肽段上有1个磷酸化位点，526条(7.94%)磷酸化肽段上有2个磷酸化位点；还有21条(0.32%)磷酸化肽段带有3个或4个磷酸化位点(图2(a)所示，见第298页)。此外，在检测到的6 910个磷酸化位点中，有5 831个(84.4%)发生在丝氨酸(pS)上，有941个(13.6%)发生在苏氨酸(pT)上，有138个(2.0%)发生在酪氨酸(pY)上。

图2 线虫总磷酸化蛋白质组的初步定量分析Fig.2 Preliminary quantitative analysis of phosphoproteomics in C.elegans(a) 鉴定到的磷酸化肽段含有不同数目磷酸化位点分布情况；(b) 总磷酸化肽段上磷酸化位点种类；(c) 正常温度下，磷酸化水平发生显著变化的磷酸化位点；(d) 高温下，磷酸化水平发生显著变化的磷酸化位点分布；(e) 高温与正常温度比较，发生显著变化的磷酸化位点。

在正常温度(20 ℃)培养条件下，磷酸化水平显著变化的磷酸化肽段(Fold Change≥2或≤0.5，P≤0.01)有478条，对应421个磷酸化蛋白质，501个磷酸化位点(pS为411个，pT为80个，pY为10个)。在高温(25 ℃)培养条件下，衰老过程中磷酸化水平发生显著变化的有628条磷酸化肽段，对应530个磷酸化蛋白质，664个磷酸化位点(pS为516个，pT为123个，pY为25个)。高温(25 ℃)与正常温度(20 ℃)培养相比，磷酸化水平发生显著变化的有410条磷酸化肽段，对应365个磷酸化蛋白质，427个磷酸化位点(pS为343个，pT为66个，pY为18个)。

2.3 差异磷酸化蛋白质的亚细胞定位预测

通过在线软件WoLF PSORT(https: ∥wolfpsort.hgc.jp/)进行差异显著磷酸化蛋白质的亚细胞定位预测，主要就常温衰老过程、高温衰老过程、温度影响导致变化三方面进行了分析。线虫在常温衰老过程中成虫期的第10天/第5天，第5天/第1天，第10天/第1天两两比较，得到显著变化的磷酸化蛋白。高温衰老过程分析同理。温度影响导致变化采用25 ℃第1天/20 ℃第1天，25 ℃第5天/20 ℃第5天，25 ℃第10天/20 ℃第10天两两比较，得到显著变化的磷酸化蛋白质。根据图3，差异显著的磷酸化蛋白质定位在细胞核、细胞质、细胞膜、线粒体、细胞外等，其中最多定位在细胞核，显示细胞核中磷酸化蛋白质丰度随着衰老或者温度的影响变化最为突出。细胞核作为真核生物重要的细胞结构，是遗传与代谢的调控中心。细胞核在衰老过程中可能出现染色质重塑、转录水平改变、组蛋白修饰等现象[15]，是细胞衰老过程中的重要场所。细胞质对于细胞功能至关重要，其中包含线粒体、高尔基体、核糖体等细胞器，能够发生复杂的生命活动，与衰老过程息息相关。

图3 差异显著的磷酸化蛋白质的亚细胞预测定位Fig.3 Subcellular localization prediction of significantly regulated phosphoproteins(a) 常温衰老过程中显著变化的磷酸化蛋白质亚细胞定位；(b) 高温衰老过程中显著变化的磷酸化蛋白质亚细胞定位；(c) 高温相对于常温相同时间点显著变化的磷酸化蛋白质亚细胞定位。

2.4 差异磷酸化蛋白质的氨基酸保守基序分析

激酶能够识别特定氨基酸的保守基序(motif)，然后将底物磷酸化。通过在线分析工具MOMO Modification Motifs(https: ∥meme-suite.org/meme/tools/momo)进行motif分析。对于常温和高温衰老过程各自Day10/Day5，Day10/Day1，Day5/Day1进行两两比较，得到的差异显著的磷酸化肽段(Fold Change≥2或≤0.5，P≤0.01)分成上调、下调两组，对于温度影响，则将3个时间节点的25 ℃/20 ℃比较。在常温衰老过程中，磷酸化水平上调的有304条肽段，下调的有183条肽段。在高温衰老过程中，磷酸化水平上调的有363条肽段，下调的有273条肽段。高温相对于常温，磷酸化水平出现上调有242条肽段，下调有172条肽段。图4展示了这些磷酸化肽段的保守基序分析结果。

图4 线虫衰老过程中显著变化的磷酸化蛋白的保守基序识别Fig.4 Motif discovery on significantly changed phosphoproteins in C.elegans during aging process(a) 常温衰老过程中显著变化的磷酸化motif(左边展示显著上调的motif—xxxxxxSPxxxxx和xxxxxxTPxxxxx；右边展示显著下调的motif—xxxRxxSxxxxxx和xxxxxxSPxxxxx)；(b) 高温衰老过程中显著变化的磷酸化motif(左边展示显著上调的motif—xxxRxxSxxxxxx， xxxxxxSPxxxxx和xxxxxxTPxxxxx；右边展示显著下调的motif—xxxRxxSxxxxxx， xxxxxxSPxxxxx和xxxxxxTPxxxxx)；(c) 温度影响导致的显著变化的磷酸化motif(xxxxxxSPxxxxx发生显著上调)。

识别到的显著变化的motif有xxxRxxSxxxxxx、xxxxxxSPxxxxx和xxxxxxTPxxxxx，其中“x”代表任意氨基酸。通过查阅文献，进一步查找能够识别这些motif的激酶。RxxS位点可以通过蛋白激酶B(Akt)、丝裂原和压力激活激酶1/2以及AMP活化蛋白激酶发生磷酸化[16]。鉴定到了AMP活化蛋白激酶的γ亚基Q22022磷酸化蛋白，通过非标记定量方法比较相对表达水平变化，发现其在常温和高温衰老过程中显著变化。S/TP位点可以通过脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶发生磷酸化，如p34cdc2(CDK1)[17]、(CDK2)[18]和Erk1。这些蛋白激酶的识别基序发生了显著变化，表明激酶活性可能在显著增加或者降低，参与线虫的衰老过程的调节。

2.5 差异磷酸化蛋白质的功能分析

使用在线软件DAVID(https: ∥david.ncifcrf.gov/home.jsp)对显著变化的磷酸化蛋白进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集(P≤0.05)，分析了常温衰老、高温衰老及温度变化导致的蛋白质功能(图5，见第300页)和通路(图6，见第300页)变化。在常温衰老过程中，显著变化的蛋白质主要参与到发育、繁殖、运动、定位等生物学过程(图5(a))，行使了蛋白或小分子结合、蛋白酶调节活性等分子功能(图5(b))。与常温衰老相比，高温衰老过程中，显著变化的蛋白质还参与了生长、代谢和生物学过程调节等过程(图5(c))，以及大分子复合物结合和核孔的结构成分的功能(图5(d))，说明一些特定的蛋白质可能参与高温加速衰老的过程。温度改变造成的显著变化的蛋白质参与了蛋白质与蛋白质、小分子、有机环状化合物等的结合，以及成长、发育和繁殖等生物学过程(图5(e，f))，表明了不同温度环境下线虫的生物学功能与过程变化。

图5 20 ℃/25 ℃下线虫衰老过程中显著变化的磷酸化蛋白的生物学功能分析Fig.5 GO analysis of significantly altered phosphoproteins in C.elegans during aging process under 20 ℃ or 25 ℃(a，b) 常温衰老过程中丰度显著变化的磷酸化蛋白质的BP和MF分析；(c，d) 高温衰老过程中丰度显著变化的磷酸化蛋白质的BP分析和MF分析；(e，f) 同一时期温度影响导致丰度显著变化的磷酸化蛋白质的BP分析和MF分析。BP: biological process，展示蛋白质参与的生物学过程。MF: molecular function，表示蛋白质的分子功能。

图6 20 ℃/25 ℃下线虫衰老过程中显著变化的磷酸化蛋白的KEGG富集分析Fig.6 KEGG analysis of significantly changed phosphoproteins in C.elegans during aging process under 20 ℃ or 25 ℃(a) 常温衰老过程中差异显著的磷酸化蛋白质的KEGG分析；(b) 高温衰老过程中差异显著的磷酸化蛋白质的KEGG分析；(c) 温度影响导致的显著变化的磷酸化蛋白质的KEGG分析。

常温衰老中KEGG分析富集到了核糖体相关通路，抗生素的生物合成、RNA转运和半乳糖代谢通路(图6(a))。高温衰老中KEGG分析富集到了核糖体和剪接体相关通路、RNA转运和抗生素的生物合成通路(图6(b))。在温度影响过程中，显著变化的有核糖体相关通路、RNA转运、脂代谢、抗生素的生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路(图6(c))。

3 小 结

长寿一直是人类关注的焦点，而想要延长寿命便需要延缓衰老。线虫因为寿命短、个体小、易于培养等优点成为衰老研究的模式生物。蛋白质磷酸化是重要的蛋白质翻译后修饰，参与生物体内的多种生命活动，参与衰老过程。为了获得更多的衰老相关磷酸化组学信息，采用DIA非标定量的方法探究不同温度条件下衰老过程中线虫体内磷酸化组学变化，并对得到的数据进行生物信息学分析。共9 145条可信度较高的磷酸化肽段被鉴定到，对应3 317个磷酸化蛋白质。经过去冗余筛选，最终6 624条磷酸化肽段被定量到，其中显著变化的磷酸化肽段有1 093条，包含1 426个磷酸化位点，对应858个磷酸化蛋白质，通过进一步的生物信息学分析，揭示了衰老相关的磷酸化组学信息。

对显著变化的磷酸化肽段的Motif分析，发现了激酶Akt、CDK1、CDK2等可能在线虫衰老过程中发挥作用。对显著变化的磷酸化蛋白质的亚细胞定位，发现显著变化的磷酸化蛋白质定位在细胞核、细胞质、细胞膜、线粒体等。通过对显著变化的磷酸化蛋白质进行GO和KEGG富集分析，发现了可能与衰老相关的蛋白功能和核糖体、RNA转运等通路，这些通路相互作用，调控着线虫体内的衰老进程。

本文通过分析DIA非标定量方法获得的数据，发现了衰老过程中变化显著的磷酸化蛋白，揭示了可能在线虫衰老过程中发挥作用的信号通路和激酶，为线虫衰老相关磷酸化组学研究提供了更多的实验思路。