朱业宝，陈立喆，王金英，江 川

（福建省农业科学院水稻研究所/福建省稻种质资源库（圃），福建福州350018）

关键字：水稻；优质；稻瘟病抗性基因；恢复系

水稻是中国最主要的粮食作物之一，以大米为主食占比超过一半，其对国家粮食安全起到重要作用。稻瘟病是水稻生产的重要病害之一。生产实践表明，培育和利用抗稻瘟病品种是最经济、有效防控稻瘟病的手段［1］。然而，由于稻瘟病菌株会发生定向变异，携带有单一或少数稻瘟病抗性基因的品种会随着种植年限的增长，品种抗性会逐渐丧失［2］。因此，筛选并应用新的抗病种质资源，将对应于各种稻瘟病菌无毒基因的水稻抗性基因都聚合到同一栽培品种中，有助于培育广谱、持久稻瘟病抗性新品种，对于水稻稳产、减少农药的使用量，降低生产成本，减少污染,保证粮食安全均具有重要的意义。

随着分子生物学的发展，国内外已克隆稻瘟病抗性基因至少有35个［3］，为稻瘟病抗性基因的检测和利用提供重要保障。目前，科研工作者对稻瘟病抗性基因在水稻种质资源的分布进行了较多的研究［4-8］，这些研究为分子标记辅助选择在新品种选育研究方面奠定了基础。在分子标记辅助选择育种也有较多研究者开展此项研究。陈建民等［9］利用与抗白叶枯病基因Xa23和抗稻瘟病基因Pi9连锁的标记，将这2个抗性基因聚合到感病杂交稻恢复系闽恢3139，改良株系所配组合基本保持闽恢3139的农艺性状和配合力，可直接应用于生产或作抗性育种亲本。倪大虎等［10］利用分子标记辅助选择和传统育种相结合的方法，将稻瘟病基因Pi9和抗白叶枯基因Xa21和Xa23聚合于同一株系中，获得了4个三基因聚合且农艺性状较好株系。闫成业等［11］通过杂交、回交和分子标记辅助选择技术，将抗褐飞虱基因Bph14和Bph15基因同时导入到水稻恢复系R1005中，获得3个含双基因株系，其中2个株系的农艺性状和R1005相近。陈红旗等［12］利用基因重组技术结合MAS技术，将分别携带稻瘟病抗性基因Pi-1和Pi-33和Pi-22个材料导入金23B中，抗病频率提高到96.7%，说明随着稻瘟病抗性基因聚合数目的增加，抗谱也显著拓宽。前人研究结果进一步证明，分子标记辅助选择改良材料稻瘟病抗性是切实可行的。

本研究通过前期已筛选到的携带多个稻瘟病抗性基因的国外引进种质资源IR79193-83-1-1-1为亲本［13］，通过杂交将抗病基因转移到恢复系材料中，对分离世代的不同基因组合材料进行稻瘟病田间抗性鉴定，同时对分离世代进行碱消值和垩白等米质性状进行筛选，以期筛选到米质优、稻瘟病抗性强的新材料，为培育具有稻瘟病抗性强的优质水稻新品种打下理论与实践基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

抗性供体亲本：国外引进抗性材料IR79193-83-1-1-1；抗性受体亲本：恢复系亲本帮恢609。

1.2 DNA提取和检测

按Wang 的SDS抽提法提取水稻基因组DNA［14］。用于PCR扩增的引物相关信息见表1。引物由华大基因合成。研究选取稻瘟病基因Pi9、Pi5、Pikm、Pita4个基因，其功能标记PCR扩增方法参照表1相应文献。PCR产物检测在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，用4S GelRed核酸染料染色后，在凝胶成像系统上拍照。为确保结果准确、可靠，每个样品扩增2次。

表1 稻瘟病相关基因的基因型鉴定涉及的引物序列及相关信息

1.3 群体构建与后代筛选

2016年海南以帮恢609为母本，IR79193-83-1-1-1为父本配制杂交组合，2017年将乐中稻种植F1，2017年海南陵水种植2 000株F2，通过表型筛选获得株叶态较好材料105份，从F2开始，每代均开展米质和外观筛选和稻瘟病基因分子标记辅助选择，获得恶白粒率低、碱消值高、携带抗病基因品系，并在上杭茶地稻瘟病鉴定基地进行抗性鉴定，通过连续多代的重复筛选与鉴定，获得了抗性好，米质好的品系。

1.4 稻瘟病抗性鉴定

稻瘟病自然诱发鉴定苗瘟，鉴定点选在福建省上杭县茶地镇的国家、省级水稻新品种抗性鉴定示范基地，该鉴定点属福建省水稻稻瘟病常发病、重发病地区，旱圃法鉴定，按0～9级标准调查病情，调查和评价参照统一标准进行［19］。

1.5 表型性状鉴定

农艺性状评价于2020年在海南陵水试验田进行，考察性状包含成熟期、株高、有效穗、穗长、穗粒数、结实率、谷粒长度，谷粒宽度、千粒重等性状，谷粒性状用万深大米外观品质检测仪（型号：SC-E）采集数据。农艺性状、恶白粒率和碱消值评价标准参照水稻种质资源描述规范和数据标准［20］。

2 结果与分析

2.1 亲本抗性、米质外观及碱消值检测

对亲本帮恢609和IR79193-83-1-1-1进行稻瘟病自然诱发鉴定、碱消值测定和恶白粒率鉴定，结果表明帮恢609表现感病，碱消值为3级，恶白粒率85%左右，IR79193-83-1-1-1表现抗病，碱消值为7级，恶白粒率5%左右。

2.2 分子标记辅助改良帮恢609的稻瘟病抗性

表型筛选获得株叶态较好材料105份，利用与Pi9、Pi5、Pikm、Pita等4个基因的功能性分子标记对材料进行检测，选择含有抗性基因的单株加代选择，并在隔代上杭茶地进行稻瘟病抗性鉴定，最终筛选出5份农艺性状优良、群体稳定的、含有目标基因（Pi9、Pi5）且田间表现抗稻瘟病的高代株系材料。

2.3 改良恢复系的主要农艺性状分析

从F2代开始即对表型筛选获得株叶态较好材料进行恶白粒率和碱消值鉴定筛选，在低世代筛选高碱消值株系，后代遗传力高，低世代株系碱消值高且无分离，该株系下一代基本为碱消值高的材料，恶白粒率性状的低世代筛选能提高效率。因此，在低世代进行碱消值和恶白率筛选很有必要，可以极大减少工作量。对5份改良系和亲本在海南陵水成熟期进行农艺性状调查（表2）。从表中可以看出，创制的5个株系，有效改良了碱消值和恶白情况，基本聚合了2个亲本的优良性状。

表2 亲本及后代材料的表型考察结果

3 讨论

稻瘟病抗性和优质稻育种一直是育种家的关注焦点。随着众多抗稻瘟病基因的定位和克隆，相关基因标记的开发和应用已成为水稻抗稻瘟病育种最重要的手段之一［21-23］。分子标记辅助选择技术是随着分子生物学及生物信息学技术的发展而产生的新的选择手段，分子标记辅助选择不受基因表达、环境条件及植株生长发育阶段的影响，也不受杂交方式的影响，在植株的苗期或低世代即可进行筛选，具有较多的优点，特别是表型鉴定比较困难或表型检测费时费力的目标性状。本研究采用一次杂交，低世代进行分子标记辅助选择，结合稻瘟病抗性鉴定，能在低世代即可淘汰非目标性状株系，减少工作量并增加了选择效率。

稻瘟病基因常与不良性状连锁［24］，本研究采用连续多代的碱消值测定和恶白粒率筛选，能够快速获得碱消值高，恶白粒率低的材料，减少工作量，避免了品种选育的盲目性，证明加强对分离低世代目标性状鉴定筛选是优质稻育种的有效途径。

研究利用已知携带抗稻瘟病基因，且米质外观好，碱消值高的外引种质资源，与配合力好，但恶白粒率高和碱消值偏低的恢复系材料帮恢609杂交，通过对分离世代连续多代分子标记辅助选择、田间稻瘟病抗性鉴定、外观筛选和碱消值测定，最终获得5份携带多个抗稻瘟病基因，且米质外观好、碱消值高、抗稻瘟病强的中间材料，为下一步杂交水稻新品种选育和种质创新提供材料。