袁玉虹，董 雯，孙 艳，何天友，郑郁善cc

(1.福建林业职业技术学院，福建 南平 353000；2.福建农林大学，福建 福州 350002)

1 引言

短葶山麦冬(Liriopemuscari(Decn.)Bailey)收录在2015年版的《中华人民共和国药典》山麦冬名下[1]，为百合科山麦冬属多年生草本植物，又名福建麦冬，主要分布在福建泉州低海拔地区，我国江苏、安徽、浙江及广西等省区均有分布[2]。短葶山麦冬是集药用、食用、保健及观赏于一身的园艺植物[3]，其药用部位为干燥块根，主要具有养阴生津，润肺清心功效，在临床上治疗肿瘤、肺结核、便秘、失眠等疾病。

以山麦冬为原料各类保健饮品、药品不断被研制出来，麦冬的市场需求量上升趋势明显，而短葶山麦冬是国内主流商品麦冬类药材，有效成分含量并不低于川麦冬，具有巨大的市场开发潜力。目前短葶山麦冬以播种繁殖和分蘖繁殖为主[3]，播种繁殖成苗时间长，出苗率低、性状不稳定、易受季节限制等问题；分蘖繁殖效率慢、繁殖率低、性状易退化等风险，这两种方式均不利于短葶山麦冬作为工厂化生产种植的首选。组织培养可在不受外界环境条件的限制下实现快速大量繁殖种苗，且能较好地保持母本的优良性状[4]，是实现短葶山麦冬工厂化育苗及良种推广应用的关键技术。

目前国内关于麦冬的组织培养激素配比研究较多[5～8]，但不同的研究人员选用的激素种类、用量和组合不一样，研究的结果也不尽相同。因此，本研究采用L9(34)正交试验研究激素类型和浓度对短葶山麦冬愈伤组织诱导的影响，以提高其愈伤组织诱导率及其品质，为改良短葶山麦冬工厂化生产提供一定依据。

2 材料和方法

2.1 试验材料

选用从泉州洛江区短葶山麦冬GAP基地移栽至福建农林大学福建省中药材GAP工程技术研究中心苗圃的优良短葶山麦冬。

2.2 材料处理

选用长势较好的短葶山麦冬植株茎尖，用肥皂水浸泡15 min去除植株表面附着物，然后将植株茎尖置于流水冲洗1 h后转置超净工作台，用灭菌水冲洗3遍，用75%乙醇溶液消毒30 s后再用灭菌水冲洗3遍，然后置于0.1%升汞消毒剂中浸泡10 min，用灭菌水冲洗3遍。将消毒后的短葶山麦冬茎尖切取长度为5 mm的小段为外植体以备用。

2.3 愈伤组织诱导

将灭菌的外植体接种在以MS为基本培养基，添加不同植物生长调剂诱导愈伤组织。激素浓度配比采用L9(34)正交试验设计(表1)，以2，4-D、6-BA、NAA 3个因子。其中培养基中琼脂7 g/L，蔗糖浓度为30 g/L，pH值调至5.8。每个处理接种外植体30瓶，每瓶一个外植体，3次重复，30 d后统计愈伤组织生长情况及诱导率。

表1 愈伤组织诱导L9(34)正交试验设计

2.4 愈伤组织继代培养

选取生长状况较好的愈伤组织接种在以MS为基本培养基，添加不同植物生长调剂进行继代培养。激素浓度配比采用L9(34)正交试验设计(表2)，以2，4-D、6-BA、NAA 3个因子。其中琼脂7 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8。每次20瓶，每瓶接种愈伤组织重量为0.2 g，45 d后统计出愈伤组织培养过程中的增殖系数。

表2 愈伤组织继代培养L9(34)正交试验设计

2.5 不定芽诱导

选取生长状况较好的愈伤组织接种在以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA+NAA 0.5 mg/L激素组合进行对不定芽诱导,6-BA浓度配比如表3。其中琼脂7 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8。每个处理接种20瓶，每瓶接种2～3个愈伤组织，3次重复，45 d后统计分化情况并计算诱导率。

2.6 数据分析

采用Excel和SPSS17.0进行数据计算和统计分析，并对结果进行多重比较。

3 结果与分析

3.1 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响

短葶山麦冬外植体接种后，第9 d后开始长出愈伤，30 d后统计各处理的出愈率及愈伤生长状况。由表4可见，激素配比组合5出愈率优势明显，达94.55%，且愈伤组织质量最佳(图1)，其次是组合7，出愈率81.13%，愈伤组织质量中上。从表5方差分析看出，NAA和2,4-D对短葶山麦冬茎尖愈伤组织秀导率存在显著影响。由极差分析结果表明，影响短葶山麦冬茎尖愈伤组织因素的激素主次顺次为：2.4-D>NAA>6-BA，就出愈率而言最优组合为A2B1C3，即激素配比2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA的MS培养基诱导愈伤组织效果最佳。同时，从图2可以得知，在一定范围内，随着2,4-D和NAA浓度的增加，愈伤诱导率呈先上升后下降的趋势，可能高浓度的植物激素会抑制愈伤组织的形成；随6-BA浓度的增加，愈伤诱导率呈逐渐递减的趋势。

表3 不定芽的诱导试验设计

表4 不同激素配比对短葶山麦冬茎尖愈伤诱导率极差分析

表5 不同激素配比对短葶山麦冬茎尖愈伤诱导率方差分析

图1 组合5愈伤组织诱导

3.2 不同激素配比对继代增殖的影响

从表6可以看出，短葶山麦冬愈伤继代增殖系数最高的处理为组合6，即1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA，增殖系数达到5.1，与组合5相比增殖系数差异不明显显著高于其他激素配比组合。从表7方差分析看出，2.4-D浓度和6-BA浓度对对短葶山麦冬愈伤组织继代增殖系数的影响达到显著水平(P<0.05)，由极差分析结果显示，影响愈伤组织继代增殖系数因素的激素主次顺次为：2.4-D>6-BA>NAA，就增殖系数而言最优组合为A2B3C2，即激素配比1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA的MS培养基愈伤组织继代培养效果最佳。2,4-D和6-BA浓度在一定范围内，愈伤组织的增殖系数随浓度的升高呈先上升后降低的趋势，说明激素浓度过高或过低都不适合愈伤组织的继代培养。NAA浓度在0～0.1 mg/L之间愈伤组织增殖系数无显著变化。

图2 不同激素因素水平与短葶山麦冬愈伤诱导率关系趋势

表6 不同激素配比对愈伤组织继代增殖培养极差分析

表7 不同激素配比对愈伤组织继代增殖培养方差分析

3.3 不同6-BA浓度对愈伤组织不定芽分化的影响

由表8可知，不同浓度6-BA对短葶山麦冬愈伤组织再生的影响存在着明显差异。出芽效果最好的为组合7，即6-BA浓度为4.0 mg/L时，短葶山麦冬愈伤组织不定芽增殖系数达到5.54，分化出丛生芽，苗高且叶粗(图3)。6-BA浓度在1～8 mg/L范围内，随着6-BA浓度的增加，愈伤组织的分化呈先上升后下降的趋势(图4)。

表8 不同浓度6-BA对愈伤不定芽分化的影响

图3 组合7不定芽分化状况

图4 不同浓度6-BA对不定芽分化的趋势

4 结论与讨论

植物激素是影响植物组织培养是否成功的关键因素[9]。在组织培养中基本培养基MS仅能保证外植体存活，要获得优质的试管苗必须在基本培养基中添加植物生长调节剂。不同植物生长调剂的不同浓度配比对外植体生长和分化作用不同，如生长素类主要是诱导外植体产生愈伤组织和促进不定根的发生，细胞分裂素类常用来诱导不定芽的形成。

以短葶山麦冬茎尖为外植体，在愈伤组织诱导和继代培养阶段选用不同浓度配比2,4-D、NAA和6-BA。本试验结果显示愈伤组织诱导率最佳的激素配比为：2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/LNAA，出愈率达到94.55%，愈伤组织质地紧密，生长旺盛，质量最优。相关研究表明，2,4-D和NAA可显著诱导愈伤组织形成[10～12]，与本研究结论一致。其中，2,4-D对愈伤组织的诱导影响最大，且浓度在0～2 mg/L范围内，与愈伤组织生长呈正相关。

从愈伤组织中大量快速增殖是工厂化育苗快速繁殖一个重要途径[13]。本试验发现将2,4-D浓度降低至1.0 mg/L，激素配比为1.0mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA的继代培养基上，短葶山麦冬愈伤组织净增鲜重为1.08g，增殖系数达到5.1。万学锋[14，15]研究发现短葶山麦冬茎尖诱导产生的愈伤组织比较致密，不能满足继代增殖需要，必须改变培养基中激素配比，降低2,4-D的浓度能使愈伤组织细胞结构发生变化，与其研究结论一致。前人研究发现植株再生培养中6-BA对芽增殖起重要作用，且与低浓度的生长素配比可更有利于不定芽的形成[16，17]。在MS培养基中添加4 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA，不定芽增殖系数达到5.54，分化出丛生芽，苗高且叶粗，效果最佳，且当NAA浓度相同时，6-BA浓度在0～4 mg/L范围内，与不定芽的形成呈正相关。