填埋场好氧修复过程中细菌群落结构和功能的变化趋势研究＊

2022-07-01蔡伽怡王思淇陈朱琦

环境卫生工程 2022年3期

蔡伽怡，席爽，王思淇，姜旺，汪佳，陈朱琦

（1.华中科技大学化学与化工学院，湖北武汉 430074；2.中国市政工程中南设计研究总院有限公司，湖北武汉 430010）

1 引言

我国早期生活垃圾主要以简易堆放的方式进行处理，没有渗滤液、填埋气收集处理等无害化污染防控措施。随着对环境质量重视程度的不断提高，逐渐由此前的简易堆放方式转变为卫生填埋方式［1］。自CJJ 17—1988 城市生活垃圾卫生填埋技术标准颁布起，生活垃圾卫生填埋技术经过40 a 的发展日渐趋于完善。但卫生填埋技术逐渐完善的同时，早年启用的不符合标准要求的老旧垃圾填埋场逐渐接近或已达到设计库容，进入封场阶段［2］。据统计，我国每年生活垃圾简易堆放量或处理量达到3.300×107t，占用土地面积达到5.5×108m2，全国非正规堆放点超过3 000 座［3］。简易填埋作业方式存在着占用大量优质土地资源、未经防渗处理的渗滤液污染地下水和土壤、甲烷直接排放等问题，存在很高的环境风险［4］。

为了解决上述问题，好氧修复技术通过对垃圾堆体进行抽注气［5］、渗滤液回灌［6］等方式，使垃圾堆体处于好氧状态并拥有适宜的含水率，创造有利于好氧微生物生存的环境，从而加快垃圾中有机质的降解速率，快速削减污染负荷，缩短堆体稳定化所需要的时间，实现垃圾填埋场土地的再利用［7］。好氧修复技术目前已被用于国内外数座填埋场的修复工程当中，例如：意大利Tor⁃retta 填埋场［8］，武汉金口垃圾填埋场［9］，武汉北洋桥、岱山、紫霞观垃圾填埋场，北京黑石头消纳场［10］等。好氧修复虽被用于实际工程当中，但堆体厌氧/好氧转化过程中细菌群落的变化却鲜有研究。

好氧修复过程中，填埋堆体污染负荷削减依赖于其中的细菌等微生物对污染物的代谢作用，不同群落的细菌代谢污染物的效率与特征有所不同。在堆体厌氧/好氧环境的转化过程中，细菌群落结构发生变化，可能引起污染负荷削减的速率与特征的变化，最终导致填埋堆体的宏观污染特征参数的变化。因此，细菌群落组成和代谢功能对于解释填埋场稳定化进程具有重要意义。近来，高通量测序、宏基因组等生物技术已被广泛应用于探究传统厌氧填埋场中微生物群落组成的研究中。Wang 等［11］利用MiSeq 测序调研了扬州某填埋场微生物的组成和结构，发现垃圾填埋场的微生物群落结构与堆体的电导率、有机物和水分含量相关性较大。何芝等［12］利用高通量测序技术Il⁃lumina MiSeq 对典型生活垃圾填埋场覆盖土中的微生物群落结构进行了分析，位于不同城市的填埋场覆盖土中微生物多样性指数不同，其中广东深圳填埋场土样的物种种类高于其他填埋场。黄耀民等［13］研究了短期填埋龄堆体中微生物的群落结构特征，微生物多样性会随着填埋场深度的增加而逐渐降低。

高通量测序技术广泛应用于厌氧垃圾填埋场微生物群落结构和功能的研究中，但对于老旧垃圾填埋场好氧修复过程的细菌群落变化却鲜有详细研究。本研究利用第二代高通量测序技术Illumi⁃na MiSeq 和PICRUSt 分析来表征武汉紫霞观垃圾填埋场好氧修复前后细菌群落结构和代谢功能的变化以及群落结构和环境因子的相关性。此外，还探究了填埋场不同深度、与注气井距离对于其中细菌群落结构的影响。

2 材料与方法

2.1 场地特征与样品采集

垃圾样品取自武汉市紫霞观垃圾填埋场好氧修复区域（图1）。该垃圾填埋场位于汉阳区汉江大堤内侧，紧邻汉江，现汉水公园西侧。填埋场于1991年建成运行，2009 年关闭使用，服务年限为18 a，场地总面积约为30.2 hm2，垃圾填埋深度为8～20 m。填埋场中垃圾成分较为复杂，运行过程中根据填埋需求，有时为生活垃圾，有时为建筑垃圾，有时二者混填。垃圾总量为3.928×106m3，其中生活垃圾占总量的53.8%，建筑垃圾占总量的46.2%。如图1（a）所示，对填埋场西南角区域进行好氧修复，面积为7.06 hm2。好氧修复系统由渗滤液抽注（余量渗滤液采用两级DTRO+MVR 机械蒸发处理）和填埋气抽注（抽出填埋气采用脱硫过滤+热风氧化处理）两个子系统构成。渗滤液抽注系统包含渗滤液提升井10 座和渗滤液回灌横井20 座，总抽、注水量根据现场实际水位和垃圾湿度情况通过PLC系统调节潜污泵流量实现自动控制。填埋气抽注系统包括抽气井98 座，注气井95 座，间距为25 m，平均井深为15 m，布井方式为正方形网格状，满负荷运行时总抽、注气量均为1 000 m3/min。

固体样品取自好氧修复区注气井旁，取样单元分布如图1（b）所示，考虑到垃圾堆体的非均质性、不同区域填埋深度的差异，选取填埋深度由浅至深的3 个样品单元。其中，取样单元1、2和3 的填埋深度分别为9、13、20 m。如图1（c）所示，每个取样单元中，按照与注气井间距由远至近为A、B、C 点，间距分别为4.5、9.0、13.5 m，每个采样点钻井深度为10 m，除去覆盖土后分别于深度0～3 m 和4～6 m 处取得浅层垃圾样品，每个取样点（不同位置和深度）取3 个平行样品。固体样品取样时间为好氧修复开始前（S0d）和好氧修复30、60 d 后（S30d、S60d）。渗滤液样品取自填埋场渗滤液调节池和渗滤液收集井，渗滤液样品取样时间为好氧修复开始前（L0d）和好氧修复30、60 d 后（L30d、L60d）。采集到的样品送回实验室于4 ℃保存。

图1 填埋场分区和取样点位分布Figure 1 Landfill distribution and sampling sites

2.2 DNA 提取和测序

采集到的垃圾和渗滤液样品先经预处理后，再进行DNA 的抽提。5 g 的固体样品与25 mL（pH = 7.6）的磷酸盐缓冲液混合，在涡旋搅拌器上搅拌5 min，弃去上清液，重复3 次，得到预处理后的样品。渗滤液样品经0.22µm 滤膜过滤，滤膜利用无菌剪刀剪碎。预处理后的样品利用DNeasy@PowerSoli Pro Kit（Qiagen）试剂盒进行抽提DNA，提取的DNA 浓度利用Nanodrop 分光光度计进行定量，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量。合格的DNA 样品委托上海派森诺生物科技有限公司对细菌16S rRNA V3-V4 区进行PCR 扩增（扩增引物为F:ACTCCTACGGGAG⁃GCAGCA，R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT），通过Illumina Miseq 平台进行测序。

2.3 数据分析

测序得到的原始数据以FASTQ 格式保存。QI⁃IME2 软件用于进行序列去噪和OTU 聚类分析，使用R 语言脚本，对全部样本中所包含的高质量序列的长度分布进行统计。对比Greengenes 数据库，进行物种分类学注释。微生物群落的多样性和丰度通过Chao1、Observed Species、Shannon 和Simp⁃son 多样性指数进行表征。PICRUSt 用于预测确定序列的功能。冗余分析（RDA）研究环境因子与群落结构的相关性。

3 结果与讨论

3.1 好氧曝气后细菌群落变化

3.1.1 群落结构组成分析

如图2 所示，在填埋场开始好氧修复前，堆体处于厌氧状态，固体废物分解中最丰富的细菌门分别为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Fir⁃micutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、同力菌门（Synergistetes）、热袍菌门（Thermotogae）、暗黑菌门（Atribacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和柔壁菌门（Tenericutes）。其中，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是主要的细菌门类，相对丰度占整体的94%，这与此前高通量测序技术得到的结果一致［14］。渗滤液样品中，群落组成与固体样品有较大差异，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门3 种细菌门类相对丰度仅为71%［15］。

图2 垃圾堆体和渗滤液门水平上细菌的物种组成Figure 2 Species composition of bacteria on phylum level in landfill and leachates

堆体进行好氧修复后，群落结构组成发生了明显的变化。好氧修复60 d 后，填埋场堆体中变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门3 种主要的细菌较完全厌氧状态有明显变化，其中变形菌门的相对丰度由7.0%增加为26.4%，厚壁菌门的相对丰度由77.6% 减少为38.8%，拟杆菌门的相对丰度由10.2%减少为5.3%。上述3 种填埋场主要细菌门水平上的变化趋势符合填埋场细菌群落好氧阶段的规律，填埋场好氧状态相较严格厌氧状态，细菌群落会有较多的变形菌门以及较少的厚壁菌门和拟杆菌门［16］。除了上述填埋场主要3种细菌外，好氧修复后细菌群落还出现了更多的放线菌门。放线菌门能承受更高的环境温度，常出现在好氧反应器中，可以分解纤维素［10］。放线菌门的出现进一步说明了堆体在好氧修复后，细菌群落呈现好氧状态。此外，垃圾堆体进行好氧修复后细菌群落结构中酸杆菌门（Acidobacteria）相对丰度增加，变为相对丰度较高的细菌门中的一种。

在渗滤液样品中，好氧修复开始后细菌群落也大体呈现出与填埋堆体类似的变化规律。好氧修复30 d 后，变形菌门的相对丰度由31.2% 增加为75.9%，厚壁菌门的相对丰度由20.6% 减少为2.8%，拟杆菌门的相对丰度由19.7% 减少为7.9%；在好氧修复60 d 后，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门分别为75.6%、9.7% 和5.6%。渗滤液样品中放线菌门的相对丰度先升高后降低，厌氧状态时放线菌门的相对丰度为2.2%，好氧修复30 d 后增加为12.0%，好氧修复60 d 后减少为1.3%。好氧修复30 d 后，渗滤液细菌群落中放线菌门的相对丰度变化规律与堆体样品一致，有助于分解其中的纤维素和木质素。好氧修复60 d 后，渗滤液细菌群落中放线菌门相对丰度的减少，可能由于该样品中细菌群落多样性相对于其他的渗滤液样品出现增加（3.1.2 节），使其相对丰度出现了减少，但更详细的原因仍需进一步研究。

在好氧修复后，无论是堆体还是渗滤液细菌群落都呈现出了明显处于好氧状态群落的特征，说明对垃圾堆体进行抽注气可以有效改变堆体的厌氧状态，转变为好氧生物反应器，有助于缩短填埋场污染负荷削减周期，使土地资源在短时间内得到释放。

3.1.2 群落组成Alpha 多样性分析

Alpha 多样性指数用于分析微生物群落的丰富度和多样性，其中Chao1 和Observed Species 指数用于表达群落的丰富度，Shannon 和Simpson 指数用于表达群落的多样性。样品中细菌的Alpha 多样性见表1。

表1 Alpha 多样性指数Table 1 Alpha diversity index

无论是垃圾堆体还是渗滤液样品，测序后样品的覆盖度（Coverage）大于0.98，稀释曲线也趋于平台期，表明该测序结果比较理想。在垃圾堆体中，好氧修复后无论是细菌群落的丰富度或是多样性都有明显的增加。在好氧曝气60 d 后，Chao1 指数和Observed Species 指数均增加，群落中存在的物种数明显增多。同时，Shannon 指数和Simpson 指数也出现了相应的升高，群落多样性也出现了明显的增加。堆体通入气体，由厌氧状态转变为好氧状态的过程中，氧气的通入改变了群落的外环境，使得更多好氧细菌出现。渗滤液样品中，群落的丰富度随时间的延长出现了明显的增加，物种数明显增加。值得注意的是，在好氧修复30 d 后群落的Shannon 和Simpson 指数与好氧修复前相比差异不大。但从整体上说，好氧修复后渗滤液样品中细菌的多样性和丰富度都略高于固体样品。在此前的研究中，传统厌氧填埋场中堆体细菌的多样性和丰富度高于渗滤液［17］，由于一些黏附于垃圾表面形成生物膜的微生物不易进入渗滤液中［14］，渗滤液仅保留了部分细菌群落的信息［18］。本研究中垃圾填埋场服务年限长，填埋深度深，不同深度的垃圾成分较为复杂。受限于取样条件，只取到了0～6 m 较浅层的垃圾样品，没有获取到深层垃圾的细菌群落信息，而渗滤液从库底收集和取样，包含了填埋场内所有细菌群落信息。基于上述原因，渗滤液样品中的细菌的多样性和丰富度都略高于固体样品。

3.1.3 细菌群落功能预测

好氧修复前后，垃圾样品中细菌群落功能预测如图3 所示，功能可以归为7 类。其中高分子改性（Macromolecule Modification）、聚糖途径（Glycan Pathways）和脱毒（Detoxification）均小于1%，代谢簇（Metabolic Clusters）占比也较少，而产生前驱代谢物质和能量（Generation of Precursor Metabolite and Energy）、降解/利用/同化（Degrada⁃tion/Utilization/Assimilation）和生物合成（Biosyn⁃thesis）是细菌群落中主要的功能。在好氧修复后，主要的3 种功能都发生了相应的变化，群落整体生物合成有机物的功能逐渐降低，由70.3% 减少为65.6%。同时，细菌群落向更倾向于产生前驱代谢物质和能量（由13.6% 变为14.5%）以及降解/利用/同化有机物（由12.4% 变为15.4%）的方向变化。细菌群落结构功能的变化解释了好氧修复可以在短时间内削减填埋堆体的污染负荷、加速填埋场稳定化进程的现象。

图3 堆体细菌功能预测Figure 3 Function prediction of solid bacteria

如图4 所示，在渗滤液样品中，与垃圾样品类似，群落的主要功能集中在产生前驱代谢物质和能量、降解/利用/同化和生物合成有机物，其余功能的占比也较少。随着好氧修复的进行，渗滤液中的细菌功能向着生物合成更少的有机物和降解/利用/同化更多有机物的方向变化，与固体样品的变化趋势一致。但在产生前驱体代谢物质和能量的功能上变化不大，没有明显的变化规律。除上述不同点外，变化程度也相对于垃圾样品较小。归因于渗滤液两个样品中有1 个取自渗滤液调节池，调节池中的渗滤液样品脱离好氧环境储存了较短的时间，其中的细菌群落略微向厌氧状态转化，群落功能变化程度相对于固体样品较小。

图4 渗滤液细菌功能预测Figure 4 Function prediction of leachate bacteria

3.1.4 渗滤液水质与细菌群落的相关性分析

采用RDA 分析填埋场好氧修复过程中渗滤液细菌群落与环境因子之间的关系。6 个样品点分别代表3 个不同好氧修复时间渗滤液调节池和填埋场渗滤液收集井的样品。带箭头的矢量线代表相应的环境因子（COD 和NH+4- N）。由图5 可知，不同好氧修复时间的样品点间离散程度较大，细菌群落差异较大，与图2（b）所示细菌在门水平上分析的结果一致。矢量线长度反映样本与环境因子的相关程度，矢量线越长，相关性越高。COD与NH+4- N 对细菌群落结构影响相关性都比较大，与渗滤液中细菌可以降解有机物、削减污染负荷的结论一致。RDA 分析中P略大于0.05，说明环境因子和渗滤液细菌群落非显著性相关，但上述结论与前文符合较好，从一定程度上可以反映二者的相关性。进一步在门水平上对细菌群落结构和环境因子的相关性进行分析，发现变形菌门、放线菌门的相对丰度与COD、NH+4- N 呈现负相关，而拟杆菌门的相对丰度和两个环境因子呈现正相关。综上所述，细菌群落中变形菌门和放线菌门的相对丰度较高有利于填埋场中主要污染负荷COD 和NH+4- N 的削减过程。

图5 渗滤液细菌群落结构与环境因子的冗余分析Figure 5 Redundancy analysis(RDA)of environmental factors and bacterial community structure of leachate

3.2 填埋场深度和与注气井间距对群落结构的影响

3.2.1 填埋场深度的影响

在填埋场中，不同位置的垃圾成分、含水率、甲烷浓度等都会有差异［18］，为非均质状态，基于上述原因，在好氧修复过程中不同深度的细菌群落结构也会有差异（图6）。在去除覆盖土后，以3 m 为1 个单位对不同深度的细菌群落结构进行分析。不同填埋深度会导致填埋场中主要的细菌门类产生差异。随着填埋深度由0～3 m 变为4～6 m，细菌群落中变形菌门的相对丰度增加（由22.7% 增加为30.1%），厚壁菌门的相对丰度增加（由37.3% 增加为40.2%），拟杆菌门的相对丰度减少（由7.3%减少为3.3%）。此外，深度0～3 m 的群落相比4～6 m 有更多负责分解纤维素的放线菌。上述的差异主要来自于不同深度的垃圾新鲜程度不一致，深度浅的垃圾填埋龄较低，有机质含量较高，垃圾稳定化程度较低，造成群落结构的差异［19］。

图6 填埋深度对细菌群落结构影响Figure 6 Effect of landfill depth on bacterial community structure

除了细菌群落结构，填埋深度也会使群落的Alpha 多样性产生差异，埋深较浅的堆体中细菌群落的丰富度和多样性都高于埋深较深的细菌群落。埋深由0～3 m 增加为4～6 m 时，Chao1 指数和Observed Species 指数降低，群落中存在的物种数明显减少。同时，Shannon 指数减少，Simpson指数没有变化，群落多样性有所减少，如表2所示。

表2 填埋深度对细菌群落Alpha 多样性的影响Table 2 Effect of landfill depth on bacterial community Alpha diversity index

3.2.2 与注气井间距的影响

除填埋深度外，与注气井的间距同样会影响细菌群落结构的变化（图7）。

图7 注气井距离对细菌群落结构影响Figure 7 Effect of distance from gas injection well on bacterial community structure

与注气井间距A 点＜B 点＜C 点。在3 个取样点的样品中，3 种主要的细菌组成不相同。随着与注气井间距的增加，细菌群落中变形菌门的相对丰度减少，由A 点41.0%减少为B 点的24.6%，C点进一步减少为13.7%。厚壁菌门的相对丰度增加，由A 点20.3% 增加为B 点的44.5%，C 点增加为51.4%。拟杆菌门的相对丰度增加，由A 点3.3% 增加为B 点的6.1%，C 点增加为6.5%。除了以上3 种主要的细菌外，降解纤维素的放线菌A点的相对丰度明显高于B 和C 点。

Alpha 多样性指数也受到了与注气井间距的影响，无论是反映群落丰富度的Chao1、Observed Species 指数还是反映群落多样性的Shannon 指数都随与注气井间距的增加而降低（表3）。与注气井间距越近，细菌群落多样性和丰富度越高。