殷东杰，薛梦恒，杨过，黄永康，易阳，王宏勋,3,王丽梅,3*

（1.武汉轻工大学生命科学与技术学院，湖北武汉 430023）（2.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023）（3.湖北省生鲜食品工程技术研究中心，湖北武汉 430023）

芡实（Euryale feroxSalib.）又称卵菱，为睡莲科一年生水生草本植物芡的干燥成熟种仁。芡实是我国传统的食用蔬果，栽培历史悠久，种植广泛，在我国南北各省均有分布[1]。《神农本草经》记载，芡实味甘、涩，性平，具有益肾固精、补脾止泻、除湿止带的疗效[2]，中医将其归于脾、肾二经，并广泛用于治疗遗精滑精，遗尿尿频，脾虚久泻之症[3]。现代药理学研究发现芡实具有抗炎[4]、抗心肌缺血[5]、降血糖[6,7]、抑制肿瘤[8,9]等作用。

多酚类化合物主要包括类黄酮、酚酸、单宁、香豆素类、木脂素类、芪类等物质。大量研究表明，众多植物天然多酚具有抑制肿瘤等作用，并且具有作用温和，对机体细胞毒性较低的优点[10,11]。植物天然多酚已被证明在清除导致DNA损伤、促进肿瘤发生的单线态氧和各种自由基方面十分有效[12]。Zhang[13]发现芡实壳提取物表现出抗氧化活性、自由基清除能力及对脂质过氧化的抑制作用，福林酚法及HPLC测定表明芡实壳提取物酚类物质含量丰富且主要成分为没食子酸及芦丁，推测这可能是芡实壳提取物具抗氧化能力的主要原因。Fang等[14]用植物多酚新绿原酸对移植了AGS胃癌细胞的小鼠进行处理，结果显示新绿原酸能诱导癌细胞凋亡及阻止癌细胞的迁移和侵袭。

我国芡实种植范围广，产量高，但芡实壳作为副产品被大量丢弃，未被深入研究及开发利用。相关研究表明芡实壳醇提物中含有大量酚类物质，能清除体外自由基，具有良好的抗氧化能力[15-19]。Lee等[20]发现芡实提取物具有清除高水平的DPPH自由基，抑制脂质过氧化，促进细胞活力，保护H2O2诱导的细胞凋亡并增强各种抗氧化酶的作用。WU等[21]通过小鼠体内抗氧化试验，表明口服芡实壳酚提取物可提高衰老小鼠肝、肾中SOD、CAT、GSH-Px的活性，降低MDA水平及降低小鼠游泳后BUN含量，增加HG含量，证实了芡实壳酚提取物的抗氧化活性和抗疲劳作用。

本课题组前期通过实验筛选发现，芡实壳醇提物对人肝癌HepG2细胞及人胃癌SGC7901细胞的抑制增殖作用较强。为进一步评价芡实壳醇提物生物活性，本文考察芡实壳醇提物对人肝癌HepG2细胞及人胃癌SGC7901细胞的体外抗肿瘤活性并初步探讨可能的作用机理，为抗肿瘤天然产物资源筛选提供依据，也为芡实资源综合开发利用提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芡实壳，购买自武汉武商量贩超市；DMEM、F12培养基、PBS，Hyclone公司；FBS、双抗、胰蛋白酶，杭州四季青生物工程材料公司；细胞凋亡试剂盒、细胞周期检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、细胞内钙离子浓度检测试剂盒，Solaibio公司；人胃癌细胞株SGC7901、人肝癌细胞株HepG2，湖北百奥斯生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪，Thermo Fisher公司；离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；微量移液器，德国Eppendorf公司；T25培养瓶、96孔板、冻存管、6孔板，美国Coming公司；SCHP-80 CO2培养箱，常州恒德仪器有限制造公司；流式细胞仪，BD公司。

1.3 方法

1.3.1 芡实壳醇提物制备过程

取新鲜芡实壳置于50 ℃烘箱内烘干，研磨机磨碎后用75%乙醇超声提取，经真空冷冻干燥机浓缩冻干后得到芡实壳醇提物冻干粉。

1.3.2 CCK-8法检测芡实壳提取物对肿瘤细胞的抑制率[22,23]

取处于对数生长期的SGC7901细胞及HepG2细胞，用胰蛋白酶进行消化，用含有10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基吹打为细胞悬液，调整细胞密度为4×104cells/mL，接种于96孔板，每孔100 μL。于37 ℃，含5% CO2的培养箱中培养24 h，弃去培养基，PBS冲洗后加入含有不同浓度芡实壳醇提物的培养基100 μL，分别培养24 h、48 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，孵育3 h后用酶标仪测定450 nm处吸光值。细胞增殖抑制率计算公式为：

1.3.3 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡[24,25]

取处于对数生长期且密度为1×105cells/mL的细胞悬液并接种于6孔板中，每孔1 mL，培养24 h后加入1 mL含不同浓度芡实壳醇提物的培养基，继续培养24 h。胰蛋白酶消化离心后收集细胞，预冷PBS洗涤细胞两次，弃去PBS，用Annexin V结合液调整悬浮细胞密度为5×104cells/mL，加入5 μL Annexin V-FITC染色液4 ℃避光染色15 min，加入10 μL PI染色液4 ℃遮光孵育5 min，用流式细胞仪进行检测。

1.3.4 细胞周期检测[26,27]

取处于对数生长期且密度为1×106cells/mL的细胞悬液并接种于6孔板中，每孔1 mL，培养24 h后加入1 mL含不同浓度芡实壳醇提物的培养基，继续培养24 h。胰酶消化细胞，4 ℃、1500 r/min离心5 min收集细胞，预冷PBS洗涤细胞两次，弃去PBS，加入预冷的75%乙醇，4 ℃固定过夜。离心收集固定后的细胞，加入RNA酶200 μL，37 ℃避光孵育30 min，再加入PI 100 μL并在4 ℃避光染色30 min，用流式细胞仪进行检测。

1.3.5 细胞线粒体膜电位检测

取处于对数生长期且密度为1×105cells/mL的细胞悬液并接种于6孔板中，每孔1 mL，培养24 h加入1 mL含不同浓度芡实壳醇提物的培养基，继续培养24 h。胰蛋白酶消化离心后收集细胞，加入0.5 mL JC-1染色工作液37 ℃孵育20 min，JC-1染色缓冲液冲洗细胞2次，并调整悬浮细胞密度为5×104cells/mL，用流式细胞仪进行检测。

1.3.6 细胞钙离子浓度检测

取处于对数生长期且密度为1×105cells/mL的细胞悬液并接种于6孔板中，每孔1 mL，培养24 h后加入1 mL含不同浓度芡实壳醇提物的培养基，继续培养24 h。胰蛋白酶消化离心后收集细胞，HBSS清洗两次后调整细胞密度为5×104cells/mL，加入BB cell Probe TM F3染色工作液，在37 ℃孵育20 min。HBSS洗涤细胞2～3次重悬细胞，37 ℃孵育10 min，用流式细胞仪进行检测。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行数据分析，统计数据采用均值±标准差（Mean±SD），组间差别采用独立样本t检验，α=0.05，p＜0.05则表明差异具统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 芡实壳提取物组分分析

用75%乙醇对芡实壳回流提取并采用福林酚法测定其总酚含量[28]，由表1可知，芡实壳醇提物样品中总酚含量约为 43.96%，得率达 9.19%。用UPLC-HR-MS法鉴定芡实壳醇提物中主要有效成分，结果表明老歡草素、柯里拉京、1,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖、鞣花酸、石榴皮苦素B为醇提物中主要的多酚类物质。单恬恬[29]通过CCK-8增殖实验表明，芡实壳醇提物中具抗肿瘤活性的主要多酚类物质有鞣花酸、柯里拉京、老鹳草素。

表1 芡实壳醇提物多酚含量 Table 1 The content of polyphenols in the ethanol extract of Euryale ferox seed shell

2.2 芡实壳醇提物对肿瘤细胞体外抑制作用

利用CCK-8法分别测定芡实壳醇提物对SGC7901及HepG2细胞的生长抑制作用。由表2数据分析可知，芡实壳醇提物作用SGC7901细胞24 h后，在100～800 μg/mL浓度范围内有显著抑制作用，抑制率在37.40%～58.22%之间（p＜0.05）；醇提物作用SGC7901细胞48 h后，在50～800 μg/mL浓度范围内有显著抑制作用，抑制率在33.44%～92.31%之间（p＜0.05）；醇提物作用HepG2细胞24 h后，在200～800 μg/mL浓度范围内有显著抑制作用，抑制率在35.52%～57.26%之间（p＜0.05）；醇提物作用HepG2细胞48 h后，在100～800 μg/mL浓度范围内有显著抑制作用，抑制率在50.83%～98.18%之间（p＜0.05）。随细胞处理时间及芡实壳醇提物剂量的增加，两种细胞的增殖抑制率呈现明显上升趋势，这表明芡实壳醇提物对SGC7901及HepG2细胞增殖影响具有显著的时间及剂量依赖性。Nam等[7]研究结果表明，150 μg/mL芡实壳醇提物作用A549细胞、HepG2细胞、Hep3B等细胞24 h后，对各种细胞抑制率都在35%以上，说明芡实壳醇提物对这些肿瘤细胞的增殖都具有一定抑制作用。

表2 芡实壳醇提物对SGC7901及HepG2细胞增殖影响 Table 2 Inhibition of SGC7901 and HepG2 cells by Euryale ferox seed shell ethanol extract

由表3可知，芡实壳醇提物对SGC7901和HepG2细胞作用24 h的IC50分别为457.69、556.52 μg/mL；作用48 h的IC50分别为87.05、148.59 μg/mL。数据表明芡实壳醇提物对SGC7901细胞的增殖抑制效果略高于HepG2细胞。

表3 芡实壳醇提物对SGC7901及HepG2细胞作用IC50值 Table 3 IC50 of SGC7901 and HepG2 cells by effect of Euryale ferox seed shell ethanol extract

2.3 芡实壳醇提物对细胞凋亡的影响

如图1和图2所示，采用FITC-Annexin V/PI双染法检测芡实壳醇提物对SGC7901及HepG2细胞凋亡影响。结果显示芡实壳醇提物可促进SGC7901及HepG2细胞凋亡，随芡实壳醇提物浓度增加，细胞凋亡比例也随之增大，表明芡实壳醇提物对两种癌细胞的促凋亡作用具有浓度依赖性。

由图3可知，晚期凋亡细胞在总凋亡细胞中占多数，表明流式结果具说服力；SGC7901在芡实壳醇提物作用下凋亡率高于HepG2细胞。与空白组相比，醇提物浓度高于50 μg/mL时可显著促进SGC7901细胞凋亡，高于100 μg/mL时可显著促进HepG2细胞凋亡。曾军英等[30]用垂盆草醇提物对HepG2细胞进行处理，表明该醇提物可通过抑制Mcl-1和Bcl-2的表达来抑制HepG2细胞的增殖并诱导其凋亡。

2.4 芡实壳醇提物对细胞周期的影响

芡实壳醇提物对HepG2及SGC7901细胞的细胞周期均存在一定影响。细胞周期检查点被阻滞可引起细胞异常增殖及引发细胞凋亡。由图4可知，芡实壳醇提物浓度在50～200 μg/mL范围时，随芡实壳醇提物浓度增加，HepG2中G0/G1期细胞含量显著降低而S期细胞含量显著升高，G2/M期细胞含量无明显变化，表明细胞被阻滞在S期检查点，醇提物浓度继续升高则对细胞周期无明显影响。

图5中，芡实壳醇提物浓度低于200 μg/mL时对SGC7901细胞周期无明显影响；当浓度在200 μg/mL以上时，随着醇提物浓度升高，G0/G1期细胞含量逐渐增加，细胞阻滞于G0/G1期，这表明细胞无法顺利通过G1检查点而被阻滞在G0/G1期。芡实壳醇提物浓度为800 μg/mL时，HepG2和SGC7901细胞中处于G2/M期的细胞所占比例较其他对应组别明显增加。G2/M检查点有着调节细胞复制的作用，推测芡实壳醇提物可能通过影响细胞周期来促使凋亡过程发生。

综上所述，芡实壳醇提物浓度在50～200 μg/mL范围内可使HepG2细胞阻滞于S期检查点。李科[31]研究白藜芦醇对HepG2细胞周期的影响，结果表明白藜芦醇可以将HepG2细胞阻滞在S期从而抑制HepG2细胞的增殖，作用机制可能与CDK2及Cyclin E的活性有关；当提取物浓度在200 μg/mL以上时，SGC7901细胞被阻滞在G0/G1期而无法顺利通过G1检查点。闫开旭[32]将没食子酸作用于SGC7901细胞，结果显示G0/G1期细胞数目与没食子酸浓度呈正比，且早期凋亡细胞数目与没食子酸浓度也呈现出正相关，表明没食子酸可影响SGC7901细胞周期并促使其凋亡，Western Blot检测结果表明其机制可能是阻碍了Cyclin D1的表达。

2.5 芡实壳醇提物对细胞线粒体膜电位的影响

芡实壳醇提物可使SGC7901细胞线粒体膜电位下降且呈显著浓度依赖性。线粒体膜电位对营养物质氧化分解、维持胞内能量供应有着重要作用。由图6可知，芡实壳醇提物可使SGC7901细胞线粒体膜电位下降且呈显著浓度依赖性（p＜0.01），醇提物浓度为200 μg/mL时SGC7901细胞线粒体膜电位下降率达21.92%。随提取物浓度不断升高，线粒体膜电位持续下降；醇提物浓度为800 μg/mL时线粒体膜电位较对照组降低56.58%。

由图7可知，相较于SGC7901细胞，芡实壳醇提物可使HepG2细胞线粒体膜电位下降更为明显，且呈显著浓度依赖性（p＜0.01）。醇提物浓度为200 μg/mL时HepG2细胞线粒体膜电位下降53.81%；醇提物浓度为800 μg/mL时线粒体膜电位较对照组降低84.90%。有研究表明，线粒体通透性转换孔（MPTP）对线粒体内钙离子稳态具有重要作用，MPTP的形成主要受BcL-2家族调节。MPTP的开放会使线粒体膜电位去极化，ATP合成不足，使得Caspases被活化，最终导致线粒体凋亡通路激活[33,34]。

综上所述，芡实壳醇提物可能通过作用线粒体膜上的Bcl-2家族蛋白来使SGC7901和HepG2细胞线粒体膜电位下降，进而激活线粒体凋亡通路从而促进细胞凋亡的发生。杭佳等[35]用白蔹主要药效成分之一没食子酸处理人肝癌HepG2细胞以研究其作用机制，结果显示没食子酸在12.5～200 μg/mL范围内对HepG2细胞生长有明显抑制作用，其抗肿瘤作用机制可能为通过降低细胞线粒体膜电位而诱导HepG2细胞凋亡。

2.6 芡实壳醇提物对细胞钙离子浓度的影响

细胞内钙离子是细胞中重要的第二信使，胞质钙离子浓度变化一定程度上可以反映出细胞所处状态，其改变与胞内多种调控相关。染料Fluo-3-AM可在胞内被分解为Fluo-3探针，结合游离钙离子后发出的荧光可被流式细胞仪捕捉，借此可对胞内钙离子浓度进行测定。图8及图9中显示各组细胞总荧光强度，Count轴为细胞数量，FITC-A表示细胞内结合钙离子后的染料荧光强度。分析可知，与空白组相比，芡实壳醇提物可显著使SGC7901和HepG2细胞内钙离子浓度升高，SGC7901细胞内钙离子浓度变化仅在醇提物浓度高于100 μg/mL时才具有显著性差异，醇提物浓度为100 μg/mL时可使SGC7901细胞内钙离子荧光强度升高17.81%，且具有浓度依赖性；HepG2细胞内钙离子浓度变化仅在醇提物浓度高于200 μg/mL时才具有显著性差异，醇提物浓度为200 μg/mL时可使HepG2细胞内钙离子荧光强度升高14.14%，且具有浓度依赖性。细胞胞质钙离子浓度可作为信号来对细胞多种活动进行调节。

相关研究表明，胞质钙离子浓度升高可使胞内稳态失调，由内质网释放至胞质中的钙离子会使细胞核及线粒体内钙离子浓度升高，线粒体摄取过多游离钙离子后会出现过载，使线粒体内膜出现损伤，导致细胞色素C释放，进而活化Caspases导致细胞凋亡[36]。由此可知芡实壳醇提物介导的SGC7901细胞凋亡可能与钙离子浓度升高密切相关。魏剑锋等[37]发现三七总皂苷在200～800 μg/mL范围内能够抑制HepG2细胞的生长并诱导其凋亡，并且具有浓度和时间依赖，检测表明其机制可能是通过影响细胞内钙离子浓度来起到肿瘤抑制作用。

3 结论

3.1 芡实壳醇提物对人胃癌SGC7901细胞及人肝癌HepG2细胞增殖皆具有一定的抑制作用，且呈时间及剂量依赖性。流式细胞仪FITC-Annexin V/PI双染法结果显示芡实壳醇提物对两种细胞均具有凋亡诱导作用。福林酚法测定结果表明芡实壳醇提物总酚含量达43.96%，推测芡实壳醇提物内含有的多酚可能是通过对活性氧进行调控来抑制肿瘤细胞增殖。

3.2 根据细胞周期、细胞线粒体膜电位及细胞内钙离子浓度的检测结果可知，细胞周期检测表明，浓度为200～800 μg/mL的醇提物可使SGC7901细胞阻滞于G0/G1期；浓度为50～200 μg/mL的醇提物可使HepG2细胞阻滞于S期；醇提物对两株细胞系线粒体膜电位均有显著影响，表明芡实壳醇提物可能通过激活肿瘤细胞线粒体通路来进一步促进细胞凋亡；芡实壳醇提物浓度升高可使两种细胞胞内钙离子浓度增高，但SGC7901细胞对醇提物的变化更为敏感。芡实壳醇提物对两种细胞作用模式不尽相同，对不同细胞可能通过激活不同的凋亡通路来诱发凋亡。

3.3 综上可知，芡实壳醇提物对人胃癌SGC7901细胞及人肝癌HepG2细胞的增殖具有一定的体外抑制作用并可促进其凋亡，且对人胃癌SGC7901细胞的抑制效果好于人肝癌HepG2细胞。推测芡实壳醇提物可能主要通过升高细胞胞质钙离子浓度使得线粒体膜电位降低，从而激活线粒体相关凋亡通路来促使HepG2细胞和SGC7901细胞的凋亡。目前，芡实壳在抗肿瘤方面的机理性研究依旧较少，结合其他多酚类物质的作用机制推测其抗肿瘤作用可能涉及多条代谢通路，具肿瘤抑制作用的芡实壳有极大的潜在商业价值，其在食品、化工等行业的开发利用还有待研究。