赵佳敏，李茜如，高飞菲，巩志国，顾柏臣，白云洁，刘 博

(内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

巨噬细胞是天然免疫系统的关键组成部分，在介导宿主炎症反应中发挥了重要作用。根据环境不同，巨噬细胞可分化为不同的表型[1]。例如，IL-4和IL-13的刺激可诱导巨噬细胞分化为M2型巨噬细胞，其特征包括精氨酸酶(Arginase)活性的显著增强和几丁质酶3样分子(Ym1)表达的上调；LPS可以诱导巨噬细胞分化为具有细胞毒性以及杀伤病原作用的M1型巨噬细胞[2]。精氨酸在M1型和M2型巨噬细胞中的代谢通路不同。在M1型巨噬细胞中，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)将精氨酸转化为NO和瓜氨酸；在M2型巨噬细胞中，Arginase将精氨酸水解为鸟氨酸和尿素[3]。有文献报道，NOS和Arginase在RAW 264.7巨噬细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中均有不同程度的表达[4-5]。巨噬细胞Arginase活性的上调有利于伤口中胶原蛋白的合成[6]。此外，在动物创伤模型中，M1型巨噬细胞可通过诱导型NOS介导的NO释放以维持正氮平衡，进而调节胶原形成和细胞增殖并促进伤口愈合[7]。在巨噬细胞从M1型向M2型极化的过程中，IL-10因其在炎症反应中发挥的重要调控作用而受到广泛的关注。IL-10是促进组织修复的重要因子，其在创面边缘角质形成细胞和浸润的单核细胞中均有表达[8]。

在免疫细胞中，NLRP3(NLR pyrin domain-containing 3)可被细菌、毒素、颗粒物和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)等微生物和非微生物因素的刺激所激活[9]。其被认为是天然免疫系统中重要的传感器和受体之一，在宿主抵御病原体感染和识别其他危险相关信号所诱发的天然免疫应答中发挥了重要作用[10]。有文献报道，NLRP3炎性小体参与巨噬细胞的极化过程[11]。例如，NLRP3炎性小体的激活有助于糖尿病人的伤口愈合，而且在轻度创伤性脑损伤中也具有潜在的促进组织修复作用[12-13]。肌成纤维细胞可以通过产生巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor，M-CSF)促进单核细胞向巨噬细胞分化，并且在诱导巨噬细胞极化和促进伤口组织修复过程中发挥了重要的作用[14]。但目前，NLRP3在小鼠肌成纤维细胞培养上清液诱导骨髓源巨噬细胞组织修复相关极化调节分子和伤口修复中是否发挥一定作用尚不明确。

本试验通过使用肌成纤维细胞培养上清液诱导骨髓源巨噬细胞，从而探讨NLRP3对骨髓源巨噬细胞组织修复相关极化调节分子和伤口修复的影响。通过动物试验以及免疫荧光进一步探讨NLRP3对小鼠皮肤伤口修复的影响。上述试验可为阐明模式识别受体NLRP3在动物伤口修复中发挥的具体作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与药品使用的试剂和药品：胎牛血清(FBS)购自Excell Biology公司；RPMI 1640培养基购自Hyclone公司；小鼠IL-10 ELISA试剂盒购自Biolegend公司；总NO检测试剂盒购自Beyotime公司；Triton X-100和1 mol/L Tris-HCl(PH=7.5)均购自Solarbio公司；氯化锰、尿素、L-精氨酸和2-异亚硝基苯丙酮均购自Sigma-Aldrich公司；IL-4、IL-13和M-CSF均购自Peprotech公司；TNF-β购自Biolegend公司；兔抗Ym1多克隆抗体购自Stemcell Technologies公司；鼠抗Arginase单克隆抗体购自SANTA公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自Cell Signaling Technology公司；双敏化学发光试剂购自Affinity Biosciences公司；Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG二抗购自Abcam公司；Alexa Fluor 647偶联的驴抗大鼠IgG二抗购自Abcam公司。

1.2 实验动物野生型C57BL/6J小鼠购自南京大学模型动物研究所，NLRP3基因敲除小鼠购自美国杰克逊实验室。本试验使用8～10周龄，体质量20 g左右的健康小鼠开展试验。

1.3 小鼠耳皮肤来源的肌成纤维细胞培养使用文献[14]方法分离野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3-/-鼠耳皮肤成纤维细胞。下列分离获得的组织和细胞均置于含5% CO2的37℃培养箱中培养。将鼠耳剪碎，在0.25%胰蛋白酶-EDTA中消化1 h。将鼠耳组织碎片置于含DMEM/F12培养基的细胞培养瓶中培养2～5 d，随后使用显微镜进行观察，判断在组织周围是否游离出成纤维细胞。培养2周后，将成纤维细胞以1×105个/孔的密度接种至6孔细胞培养板中，使用含有TGF-β(终质量浓度100 ng/L)和10% FBS的DMEM/F12培养基继续培养5 d，以诱导其分化为肌成纤维细胞。随后更换培养基培养2 d，收集细胞培养上清液，用于后续试验。

1.4 小鼠骨髓源巨噬细胞培养和诱导分化使用文献[15]方法分离野生型C57BL/6J小鼠骨髓源巨噬细胞。下列分离获得的细胞均置于含5% CO2的37℃培养箱中培养。用PBS缓冲液从小鼠股骨和胫骨中冲洗出骨髓，使用含有M-CSF(终质量浓度20 μg/L)和20% FBS的RPMI 1640培养基培养8 d。随后使用IL-4(终质量浓度20 μg/L)和IL-13(终质量浓度20 μg/L)刺激巨噬细胞48 h，诱导其分化为M2型巨噬细胞；使用LPS(1 mg/L)刺激M2型巨噬细胞24 h，诱导其分化为M1型巨噬细胞。

1.5 Arginase活性检测将巨噬细胞以2×105个/孔的密度接种于96孔细胞培养板，用含有M-CSF的完全培养基诱导并培养细胞8 d后加入IL-4和IL-13刺激48 h，以诱导巨噬细胞分化。用PBS冲洗细胞1次，加入0.1% Triton 100 μL/孔，置于摇床上室温震荡15 min，以裂解细胞，随后加入50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、100 μL/孔和100 mmol/L MnCl2、10 μL/孔。吸取96孔板中的混合液100 μL于1.5 mL离心管中，56℃孵育7 min，然后加入0.5 mol/LL-精氨酸100 μL/管，37℃孵育15 min。孵育完成后加入终止液(H3PO4∶H2SO4∶H2O=1∶3∶7)800 μL/管终止反应，随后加入6% 2-异亚硝基苯丙酮40 μL/管，混匀；95℃孵育30 min，完成后4℃孵育30 min，取200 μL上述混合液于96孔板中，使用酶标仪检测D540nm值。

1.6 ELISA检测体外培养野生型C57BL/J小鼠和NLRP3基因敲除小鼠的耳皮肤来源肌成纤维细胞，收集肌成纤维细胞培养上清液(myofibroblast conditioned medium，MFbCM)。在C57BL/J野生型小鼠骨髓源巨噬细胞中加入IL-4、IL-13和野生型C57BL/6J小鼠耳皮肤来源肌成纤维细胞培养上清液(C57BL/6J MFbCM)或NLRP3基因敲除小鼠耳皮肤来源肌成纤维细胞培养上清液(NLRP3-/-MFbCM)，处理巨噬细胞48 h。随后使用LPS刺激巨噬细胞24 h，同时设置LPS不刺激实验组，收集细胞培养上清液。按照ELISA试剂盒说明书方法检测细胞培养上清液中IL-10的分泌水平。

1.7 NO含量检测同1.6处理巨噬细胞后，仅收集使用LPS刺激后的巨噬细胞培养上清液，随后按照总NO检测试剂盒说明书方法检测细胞上清液中NO的含量。

1.8 Western blot分析使用Western blot方法对样本中蛋白表达的水平进行分析。在本试验中，Ym1一抗稀释比例为1∶1 000，二抗稀释比例为1∶7 500。

1.9 动物试验随机选取野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3基因敲除鼠，各分为6组，每组10只，使用异氟烷对小鼠进行麻醉，剃除背毛后用75%酒精对皮肤进行消毒。固定小鼠，使用直径约6 mm的圆形打孔器在小鼠背部做1个圆形创口，将小鼠单独安置在可以自由饮食饮水且温度、湿度和昼夜节律正常的环境中，使其皮肤伤口自然愈合。分别在第0，3，5，7，10及14天拍照并记录伤口的愈合情况[16]。

1.10 伤口表面积的测定在皮肤创伤后第0，3，5，7，10和14天采集伤口照片，使用图像分析工具Image J处理图像，数据表示为伤口面积。

1.11 免疫荧光法检测创伤组织中Ym1和Arginase的表达将-80℃低温保存的小鼠皮肤创伤组织移至4℃环境下缓慢解冻，制作小鼠皮肤创伤组织冰冻切片(6 μm)，使用冷丙酮固定10 min。固定完成后切片在含0.25%吐温的冷PBS中清洗3次，每次10 min。室温下使用含有5%牛血清白蛋白的封闭液孵育1 h。随后加入兔抗Ym1多克隆抗体(1∶50)和鼠抗Arginase单克隆抗体(1∶100)，在4℃避光条件中孵育过夜。孵育完成后，用含0.25%吐温的PBS洗涤3次，每次15 min，然后使用Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG二抗和Alexa Fluor 647偶联的驴抗大鼠IgG在室温条件下避光孵育1 h。使用共聚焦显微镜进行图像采集(Zeiss LSM 800，×200倍)，统计激光共聚焦所示的荧光强度。

2 结果

2.1 NLRP3对M1型巨噬细胞NO含量及IL-10表达分泌的影响在巨噬细胞中加入IL-4、IL-13以及C57BL/6J MFbCM或NLRP3-/-MFbCM，48 h 后使用LPS刺激巨噬细胞，经过24 h收集细胞培养上清液检测NO含量及IL-10分泌量。试验结果表明(图1)，C57BL/6J MFbCM和NLRP3-/-MFbCM均可上调M1型巨噬细胞中NO含量，且C57BL/6J MFbCM上调现象更为显著(P<0.001)。C57BL/6J MFbCM可显著上调M1型巨噬细胞中IL-10分泌量(P<0.001)。相反，NLRP3-/-MFbCM可显著下调M1型巨噬细胞IL-10分泌量(P<0.001)。上述结果表明，NLRP3-/-MFbCM对M1型巨噬细胞NO含量及IL-10分泌水平均具有影响。

图1 C57BL/6J MFbCM和NLRP3-/- MFbCM对M1型巨噬细胞NO含量(左)及IL-10分泌量的影响(右)

2.2 NLRP3对M2型巨噬细胞Arginase活性及IL-10表达分泌的影响在巨噬细胞中加入IL-4、IL-13以及C57BL/6J MFbCM或NLRP3-/-MFbCM，48 h后检测巨噬细胞中Arginase活性及IL-10表达量。结果表明(图2)，C57BL/6J MFbCM和NLRP3-/-MFbCM均可上调M2型巨噬细胞中Arginase活性，且C57BL/6J MFbCM上调现象更为显著(P<0.001)。C57BL/6J MFbCM显著上调M2巨噬细胞中IL-10分泌量(P<0.001)，而NLRP3-/-MFbCM对M2型巨噬细胞中IL-10表达分泌无显著影响。上述结果表明，NLPR3在激活M2型巨噬细胞Arginase过程中发挥了关键作用。肌成纤维细胞培养上清对M2型巨噬细胞IL-10的表达分泌具有上调作用，且上述诱导作用的正常实现依赖于肌成纤维细胞中NLRP3的存在。

图2 C57BL/6J MFbCM和NLRP3-/- MFbCM对M2型巨噬细胞Arginase活性(左)及IL-10分泌量的影响(右)

2.3 NLRP3在M2型巨噬细胞Ym1表达中的作用在巨噬细胞中加入IL-4、IL-13以及C57BL/6J MFbCM或NLRP3-/-MFbCM，48 h后检测巨噬细胞Ym1蛋白表达量。结果表明(图3)，在IL-4和IL-13处理巨噬细胞后，NLRP3-/-MFbCM处理的巨噬细胞中Ym1表达水平与C57BL/6J MFbCM相比处于较低水平(P<0.001)。上述结果表明，NLRP3参与了肌成纤维细胞培养上清液诱导M2型巨噬细胞Ym1的表达。

图3 C57BL/6J MFbCM(左)和NLRP3-/- MFbCM(右)对M2型巨噬细胞Ym1表达的影响

2.4 野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3基因敲除鼠背部伤口愈合情况在伤口的愈合的第0，3，5，7，10和14天分别比较野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3基因敲除鼠背部伤口的愈合情况。由表1所示结果可知，与C57BL/6J相比，NLRP3基因敲除鼠创面收缩率显著降低。结果表明，相比于野生型C57BL/6J小鼠，NLRP3基因敲除鼠伤口收缩迟缓(表1)。在皮肤损伤后第5和7天，野生型C57BL/6J小鼠创面收缩率显著高于NLRP3基因敲除鼠(P<0.001)。在皮肤损伤后第14天，野生型C57-BL/6J小鼠背部伤口基本完全愈合，而NLRP3基因敲除鼠伤口周边仍有少量坏死结痂(图4)。上述结果表明，NLRP3功能的缺失对皮肤伤口修复产生不利影响。

表1 不同天数中不同小鼠背部创面面积变化情况 mm2

2.5 创伤组织中Arginase和Ym1表达情况在野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3-/-鼠背部伤口愈合情况试验中，分析小鼠创面组织中Ym1和Arginase的表达情况。结果表明(图5)，相比与NLRP3-/-小鼠，野生型C57BL/6J小鼠创面组织中Ym1和Arginase的表达均出现显著上升(P<0.001)。此外，在第5天最为明显(P<0.001)。上述结果表明，NLRP3的缺失对小鼠皮肤创面组织中Ym1和Arginase的表达具有下调作用。

Ym1.几丁质酶3样分子；Arginase.精氨酸酶；DAPI.细胞核染色；Merge.合成图(200×)

3 讨论

研究表明，NLRP3炎性小体有助于皮肤损伤后早期炎症阶段的发生，且NLRP3参与巨噬细胞极化过程[11]。此外，当细菌感染时，NLRP3表达的缺失会导致巨噬细胞前列腺素合成分泌水平显著下降，而前列腺素是参与伤口修复反应过程中的关键脂质介质[17-18]。因此，本课题组初步推测NLRP3表达缺失可能对肌成纤维细胞培养上清液诱导的骨髓源巨噬细胞组织修复相关极化调节分子和伤口修复过程产生不利影响。结果显示(图1)，NLRP3可促进M1型巨噬细胞NO含量及IL-10分泌量，但该调控作用的发挥必须依赖于肌成纤维细胞中NLRP3的存在。在肌成纤维细胞NLRP3功能缺失的情况下，反而会导致M1型巨噬细胞IL-10的分泌量出现显著下调现象，进而对伤口修复过程产生不利影响。在IL-4和IL-13不存在的情况下，无论NLRP3功能是否完整，肌成纤维细胞培养上清液对M2型巨噬细胞IL-10的表达分泌均无显著影响(图2)。在M2型巨噬细胞中，Ym1的表达与Arginase活性试验结果具有一致性(图3)。上述结果表明，在M1型巨噬细胞中，NO含量及IL-10分泌量均依赖于NLRP3功能的完整；在M2型巨噬细胞中，在肌成纤维细胞培养上清液的诱导下Arginase活性显著增强，Ym1表达上调，进而共同促进组织修复和伤口愈合的过程，且该调控作用依赖于NLRP3。因此，推测NLRP3可能在小鼠皮肤伤口的愈合过程中发挥关键作用。

为了探究NLRP3在伤口修复过程中与巨噬细胞组织修复相关极化调节分子中的作用是否具有关联。建立野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3基因敲除小鼠背部创伤模型[16](图4)，分析创伤组织中Ym1和Arginase的表达(图5)。本课题组发现，NLRP3功能的缺失显著减缓小鼠皮肤伤口的愈合速度，且创伤组织中Ym1和Arginase的表达情况发生与细胞水平相同的变化。

综上所述，模式识别受体NLRP3对小鼠肌成纤维细胞培养上清液诱导的骨髓源巨噬细胞组织修复相关极化调节分子和伤口修复中发挥关键作用。因此，本试验可为以NLRP3为靶点的，具有促进伤口修复功能的兽医临床药物开发与应用奠定一定的理论基础。然而，NLRP3通过何种途径对肌成纤维细胞培养上清液诱导的巨噬细胞组织修复相关极化调节分子和皮肤伤口愈合过程进行调控目前尚未明确，还需在未来的研究工作中加以探讨。