王佳佳，刘玉梅，徐靖怡，朱欣妍，位 兰，朱雪敏，张自强

(河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471000)

兔巴氏杆菌病和兔克雷伯菌病是兔的常发病。兔巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的一种兔的传染病，该病无明显季节性，但冷热交替的春、秋季多发，各年龄段的兔均可感染发病，临床上以呼吸道症状为主要特征，偶见中耳炎和结膜炎[1-3]。兔克雷伯菌病是由肺炎克雷伯菌引起的以肺炎和器官化脓性炎症为主要特征的传染病[4-5]。

目前，多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌已被广泛关注，但是河南省兔多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌混合感染的报道相对较少。本研究从河南省某长毛兔养殖场采集了8份打喷嚏、咳嗽等呼吸道症状的兔肝脏、肺脏、气管和脾脏样品，经细菌分离培养、生化试验及分子生物学鉴定，分离出了8株多杀性巴氏杆菌和8株肺炎克雷伯氏杆菌，并分别对其进行了敏感药物筛选试验。为确定常用抗菌药的耐药谱，并为临床治疗兔多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌病的药物筛选提供指导依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源2021年1月，河南省某兔场成年毛兔，出现打喷嚏、咳嗽等呼吸道症状，病兔大量死亡。无菌采集8份病死兔肝脏、肺脏、气管、脾脏组织，进行病原菌的分离培养及耐药鉴定。

1.2 主要试剂与仪器LB固体培养基、LB液体培养基、血清琼脂培养基(含5%新生胎牛血清)购自北京索莱宝科技有限公司。Premix TaqTM(E× TaqTMVersion 2.0 plus dye)购自宝生物工程(大连)有限公司。DL2000 DNA Marker购自康为世纪生物科技有限公司。Proteinase K、细菌基因组DNA小量提取试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。药敏纸片、微量生化反应管购自杭州微生物试剂有限公司。试验用主要仪器包括台式冷冻高速离心机(Beckman Coulter)、普通PCR仪(Applied Biosystems 2720)、凝胶成像系统(BIORAD)、电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.3 病原菌的分离纯化无菌采集病兔肝脏、肺脏、气管、脾脏组织，分别接种于LB固体培养基和血清琼脂培养基(含5%新生胎牛血清)，37℃培养24～36 h后，观察菌落的生长情况。挑取疑似单个菌落进行分离纯化并进行革兰染色，镜检。

1.4 生化试验将纯化培养的细菌分别接入微量生化管后封口，37℃培养24～72 h，观察记录结果。

1.5 引物设计与合成参照GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌的16S rRNA基因序列，利用Primier 5.0软件设计2对引物。引物由安徽通用生物系统有限公司合成，引物序列及预期片段的大小见表1。

表1 引物序列

1.6 分子生物学鉴定取分离纯化后的菌液，根据细菌基因组DNA小量提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA。以细菌基因组DNA为模板，分别进行多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌16S rRNA基因的扩增。反应体系25 μL：DNA模板 1 μL，上、下游引物各1 μL ，Premix TaqTM12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：94℃变性 4 min；94℃ 30 s；57℃ 30 s；72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min；4℃保存。目的基因片段用2%的琼脂糖进行凝胶电泳检测，由通用生物系统(安徽)有限公司进行测序，结果与GenBank中登录的菌株进行同源性比对，并使用MEGA 7.0软件构建系统进化树。

1.7 分离菌的小鼠致病性试验将2种分离菌于37℃培养24 h后，用平板法进行细菌计数，稀释菌液浓度至108CFU/mL。将15只SPF级KM小鼠(体质量在 20 g 左右)随机分为对照组、试验1,2组，每组5只。试验1，2组小鼠按0.2 mL/只剂量分别经腹腔注射2种分离菌，对照组注射相同剂量灭菌PBS。相同环境下隔离饲养，观察记录小鼠状况，同时对发病死亡小鼠进行剖检及PCR检测。

1.8 药敏试验按照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的K-B纸片法进行实验操作和结果判断[6]。抗生素纸片包括：红霉素、庆大霉素、新霉素、四环素、多西环素 、多粘菌素B、复方新诺明、麦迪霉素、卡那霉素、丁胺卡那、环丙沙星、氨苄西林、氯霉素、头孢哌酮、头孢唑啉。

2 结果

2.1 临床剖检临床剖检发现病死兔肺充血出血，并有脓肿和灰白色小结节病灶，肺胸膜与心包胸膜有纤维素附着，肝脏淤血、肿大可见出血斑点，心内、外膜有出血斑点(图1 A～C)；胆囊肿大，充满胆汁(图1 D)；脾脏出血肿大(图1 E)；肾脏肿大，并伴有出血点(图1 F)。

A～C.胸腔、肝脏；D.胆囊；E.脾；F.肾

2.2 形态及培养特性观察经细菌分离培养，我们从8只病兔肝脏、肺脏、气管、脾脏组织中分离得到16株细菌，且8株的形态特征、生化特性和药物敏感性一致，另8株同样一致，可见此次为2种不同细菌的混合感染。经37℃培养24 h发现，细菌1在血琼脂培养基上生长良好，菌落光滑、边缘整齐，呈半透明、露珠样小的菌落(图2A)，革兰染色镜检可见革兰阴性，单个或成双存在的短小球杆菌(图2B)。细菌2在LB固体培养基上长出乳白色、湿润、闪光、凸起丰厚黏稠的大菌落(图2C)，革兰染色镜检可见短粗呈卵圆形的革兰阴性杆菌(图2D)。

2.3 生化试验分离菌的生化鉴定结果显示，细菌1和细菌2分别符合多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌的生化特性(表2)。根据分离菌的形态及培养特性观察及生化试验分析，初步判定此次分离菌为多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌，分别命名为HN-W01和LY-W05株。

表2 生化试验结果

2.4 分子生物学鉴定以提取的HN-W01和LY-W05菌株的基因组为模板，采用16S rRNA基因引物，经PCR鉴定。结果显示，获得片段大小约为643，1 494 bp(图3A,B)，与预期相符。将分离测序后的HN-W01和LY-W05菌株的16S rRNA基因进行同源性比较分析，结果显示，分离得到的HN-W01菌株与参考菌株的同源性为82.45%～99.32%，与参考菌株AY604234.1基因序列同源性最高，同源性为99.32%；分离得到的LY-W05菌株与参考菌株的同源性为99.86%～100%，与参考菌株AY540111.1同源性最高，为100%。16S rRNA基因的系统发育进化树结果显示，HN-W01株与菌株AY604234.1在同一进化分支上，为多杀性巴氏杆菌(图4A)；LY-W05株与菌株AY540111.1、MN548367.1、HQ407264.1、AB513734.1、MT12-3506.1、MN032380.1处于进化树同一簇中，且与其中菌株AY540111.1亲缘关系最近，属于肺炎克雷伯菌(图4B)。

A.细菌1在普通琼脂培养基上的菌落形态；B.细菌1革兰染色(1 000×)；C.细菌2在普通琼脂培养基上的菌落形态；D.细菌2革兰染色(1 000×)

2.5 分离菌的小鼠致病性试验用2株分离菌攻毒后，试验1,2组小鼠均表现为精神不振，食欲下降，48 h内试验组全部死亡，空白对照组小鼠正常。剖检病死小鼠发现注射巴氏杆菌组小鼠心外膜有出血点；肺脏严重出血；肝脏,脾脏淤血、肿大；肠道,肠系膜等出血。注射肺炎克雷伯菌组小鼠肺脏,肝脏,脾脏出血、肿大；肠道内有黄绿色内容物。选取死亡小鼠肺脏、肝脏、脾脏、心脏等组织病料接种LB固体培养基和血清琼脂培养基，分离的菌落特征、染色镜检、生化鉴定结果均与原分离菌株一致，PCR鉴定证实序列与原分离株相同。

A.多杀性巴氏杆菌;B.肺炎克雷伯菌;M.DL2000 DNA Marker；1.肝脏；2.肺脏；3.气管；4.脾脏

2.6 药敏试验将该多杀性巴氏杆菌与肺炎克雷伯菌分别接种到含抗生素的培养基上，测量抑制圈的直径。多杀性巴氏杆菌与肺炎克雷伯菌对不同药物的敏感性见表3。由表3可知，多杀性巴氏杆菌对庆大霉素、多西环素、多粘菌素B和氯霉素4种药物敏感，对红霉素、复方新诺明、氨苄西林、头孢哌酮不敏感，对新霉素、四环素、麦迪霉素、卡那霉素、丁胺卡那、环丙沙星、头孢唑林7种药物有较强抗性；肺炎克雷伯菌对多粘菌素和氯霉素2种药物敏感，对卡那霉素和头孢唑林不敏感，对红霉素、庆大霉素、新霉素、四环素、多西环素、复方新诺明、麦迪霉素、丁胺卡那、环丙沙星、氨苄西林、头孢唑酮11种药物有较强抗性。

A.多杀性巴氏杆菌；B.肺炎克雷伯菌

表3 药敏试验结果

3 讨论

近年来，随着我国经济的快速发展，居民对动物性产品的需求持续增长，对食品的营养价值和质量也越发重视。相较其他肉类，兔肉以其高蛋白、高矿物质、高消化率以及低脂肪、低胆固醇、低能量的特性著称，具有很高的营养和食用价值，已成为人们的一种新选择。目前，我国养兔业发展盛况空前，规模化兔场快速增加。但当前疾病问题仍旧突出，特别是传染性鼻炎、肺炎，流行性腹胀腹泻以及球虫病的发病率和死亡率仍然较高，严重阻碍了养兔业发展[7-10]。

目前，在家兔呼吸道传染病中，兔多杀性巴氏杆菌和兔肺炎克雷伯菌病流行广泛且严重。以往的报道显示，多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌在哺乳动物和禽类中均可寄生，可引起机体受到严重危害[11-12]。王锦祥等[3]从患结膜炎的病兔中发现多杀性巴氏杆菌感染；韩坤等[13]从腹泻和呼吸道症状的蓝狐病料中分离出肺炎克雷伯菌；薛念宇等[14]从体温升高、呼吸困难、不食、流涎、急性胃肠炎和急性死亡为特征的病牛中分离得到多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌。但关于多杀性巴氏杆菌与肺炎克雷伯菌混合感染兔的报道却较少见。本研究通过病原菌的分离培养、生化鉴定、分子生物学鉴定及动物回归试验等方法，分离得到了多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌。为了进一步确认两种病菌，我们对其进行了序列测定，最终证实该地区送检的病兔为多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌混合感染。

家兔感染后具有很强的传染性，因此快速有效地使用相应药物控制疾病的发生十分重要。本次对分离株进行耐药性分析发现，多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌多粘菌素B和氯霉素敏感，对其他药物有不同程度的耐药性。此次，我们选用多粘菌素B和庆大霉素对感染兔进行了治疗，病情得到良好控制。这为我国兔源多杀性巴氏杆菌和肺炎克雷伯菌的预防和治疗提供了科学参考。