侯铭源，梁艳艳，李 可，李亚宁，贾 丽，马玉忠

(河北农业大学 动物医学学院，河北 保定 071001)

子宫内膜炎是奶牛产后普遍发生的一种疾病，不仅影响着奶牛的繁殖效益和产奶量，甚至还会威胁奶牛的生命，对奶牛养殖业造成了巨大的经济损失。细菌感染是造成奶牛子宫内膜炎的重要因素，大肠杆菌是引发奶牛子宫内膜炎的主要致病菌之一[1]。由于抗生素具有价格低、疗效好、见效快等特点，被广泛应用于奶牛子宫内膜炎的治疗当中，这也导致了细菌耐药性的产生，给临床治疗带来了巨大困难[2]。细菌耐药性迅速上升的主要原因是其可以通过可移动遗传元件(mobile genetic elements,MGEs)水平转移外源性耐药基因，并整合到自身基因组之中，使耐药基因在细菌之间广泛传播造成的[3]。目前国内已有学者对奶牛子宫内膜炎大肠杆菌进行了研究，发现其耐药性较为严重，但对可移动遗传元件的研究较少[4]。

本试验拟通过采集子宫内膜炎病牛的子宫黏液，分离大肠杆菌，对其进行致病性、血清型分析及耐药性与可移动遗传元件的检测，探究河北省奶牛子宫内膜炎致病大肠杆菌的流行情况及其耐药性与耐药基因的转移规律，为该病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及实验动物药敏片购自杭州滨和微生物试剂公司；伊红美蓝和LB肉汤培养基购自北京奥博星生物技术公司；大肠杆菌O抗原单因子血清购自中国兽医药品监察所；2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker和细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技公司。SPF级BALB/c小鼠购自河北医科大学实验动物中心。

1.2 样品采集无菌条件下，采集河北省11地、市有代表性的大型奶牛场40头经诊断患有子宫内膜炎奶牛的子宫黏液。

1.3 细菌的分离纯化及形态鉴定将采集的样品接种于LB肉汤培养基中，37℃恒温摇床200 r/min培养12 h，使用三线法将培养物划线接种到伊红美蓝培养基上培养，挑取有绿色金属光泽的单一菌落纯化培养，将纯化后的菌落进行革兰染色，镜检。

1.4 大肠杆菌基因组DNA提取及鉴定按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取大肠杆菌的全基因组DNA，设计并合成大肠杆菌16S rDNA引物(16S-F:5′-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3′，16S-R:F5′-TCATCCTCTCAGACCAGCTA-3′)，对分离菌株进行PCR鉴定。PCR反应体系为20 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，超纯水6 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将PCR产物送生工生物工程(上海)公司测序。测序结果与GenBank上的大肠杆菌16S rDNA 序列进行同源性比对。

1.5 致病性试验将小鼠随机分为试验组和对照组，每组5只，雌雄各半。将每株处于对数期的菌液稀释至1.0×109CFU/mL，试验组小鼠每只腹腔注射0.2 mL，对照组注射相同剂量的生理盐水。每隔4 h观察小鼠的情况并记录。剖检死亡的小鼠，进行细菌分离鉴定。

1.6 血清型鉴定按照大肠杆菌O抗原诊断血清试剂盒说明书对大肠杆菌分离株进行血清型鉴定。大肠杆菌分离株于LB培养液中37℃振荡培养12 h后用玻板凝集试验鉴定其O血清型，使用0.5%石碳酸生理盐水作为阴性对照，观察有无自凝现象。

1.7 药敏试验采用美国临床和实验室标准协会推荐的K-B法进行14种常用抗生素的敏感性检测，将对2类以上抗生素耐药的细菌判定为多重耐药菌株。

1.8 耐药基因检测根据GenBank上引物序列设计12种耐药基因引物，引物序列和退火温度如表1所示，由生工生物工程(上海)有限公司合成。以待检测基因作为模板进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳。

表1 大肠杆菌耐药基因引物序列

1.9 可移动遗传元件检测设计I类整合子、转座子、接合性质粒及插入序列标记基因引物，引物序列和退火温度如表2所示，具体操作参考1.8。

表2 可移动遗传元件引物序列

2 结果

2.1 细菌的分离培养及鉴定将采集到的40个子宫黏液样品接种于伊红美蓝培养基，共分离出疑似大肠杆菌29株(图1)，镜检发现为粉红色短小杆菌(图2)。经16S rDNA PCR检测，PCR产物测序比对，同源性为99.00%，确定均为大肠杆菌，分离率为72.50%(29/40)。

图1 伊红美蓝琼脂平板上菌落形态

图2 分离菌的形态(1 000×)

2.2 致病性试验攻毒4 h后，小鼠头颈部被毛逆乱、精神萎靡、呼吸急促、食欲下降、眼角分泌物增多。攻毒12 h后试验组小鼠开始死亡，病死率达到60.00%～100.00%。剖检发现，死亡小鼠肠道充气肿胀，肠壁变薄，部分小鼠还有腹腔出血的现象。将其脏器触片染色，油镜观察，发现均有粉红色短小杆菌，与注射菌液形态一致，确定为该菌导致的小鼠死亡，表明29株分离菌均对小鼠有致病力。攻毒24 h后小鼠停止死亡。

2.3 血清型鉴定O抗原血清型鉴定情况见表3，其中O89和O128为优势血清型，分别为8株27.59%(8/29)和7株24.14%(7/29)。O157、O39型的菌株各1株，其他血清型10株。

表3 29株大肠杆菌血清型的检测

2.4 药敏试验耐药情况见表4，29株大肠杆菌对新霉素的耐药率最高，为68.97%(20/29)；对红霉素、四环素、头孢噻肟及强力霉素的耐药率分别为51.72%(15/29),44.83%(13/29),41.38%(12/29)和41.38%(12/29)；对阿米卡星、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星及多黏菌素B的耐药率较低。本试验中大肠杆菌的平均耐药率为35.63%。

表4 29株大肠杆菌的药敏试验

所分离的29株大肠杆菌中有2株对所有抗生素都没有耐药性，17株大肠杆菌表现出了多重耐药性，其中多重耐药的菌株对四环素类的强力霉素和四环素，氨基糖苷类的新霉素，β-内酰胺类的头孢噻肟、氨苄西林、阿莫西林和头孢拉定耐药最为普遍，均高于58.82%(10/17)。

2.5 耐药基因检测耐药基因携带情况见表5，29株大肠杆菌中qnrB、tetB、sul2及ErmB基因的检出率较高，分别为86.21%(25/29)，65.52%(19/29)，62.07%(18/29)和51.72%(15/29)；aaC4、tetA、BlaOXA及cmlA基因的检出率较低。部分PCR产物结果见图3～6。

表5 29株大肠杆菌耐药基因的检测

2.6 可移动遗传元件检测可移动遗传元件检测携带情况见表6，29株大肠杆菌中，tnp513和trbC可移动遗传元件的检出率分别为89.66%(26/29)，58.62%(17/29)，未检测出tnpU基因。部分PCR产物结果见图7，8。

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被检菌株

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被检菌株

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被检菌株

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被检菌株

表6 29株大肠杆菌MGEs的检测

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被检菌株

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被检菌株

3 讨论

牛子宫内膜炎的病原菌大肠杆菌耐药性的上升不仅会使治疗时间和成本增加，影响奶牛的生命健康，还有可能通过人与动物直接或间接的接触将耐药性传播给人类，给人类健康带来风险[5-6]。细菌自身突变获得耐药性是一个漫长且不可传播的过程，通过MGEs在细菌之间水平传播是耐药基因扩散的主要途径[7]。探究奶牛子宫内致病性大肠杆菌的耐药性及其传播规律对抑制耐药菌的传播具有重大意义。

本试验选取40头子宫内膜炎病牛的子宫黏液样本，分离出了29株大肠杆菌，进而用其进行小鼠的攻毒试验，发现试验组小鼠均有死亡，表明分离到的菌株均有致病性。通过血清型鉴定试验发现，这些细菌的优势血清为O89和O128。李巧玲等[8]在流产的蓝狐阴道内分离的大肠杆菌优势血清为O89，与本试验结果相似，说明血清型为O89的大肠杆菌可能是宫内重要致病菌。

通过对耐药表型的检测，发现共有17株大肠杆菌表现为多重耐药，占总体的58.62%(17/29)，新霉素68.97%(20/29)和红霉素51.72%(15/29)耐药率最高，β-内酰胺类抗生素的耐药性普遍较高，分析可能是β-内酰胺类抗生素使用过多造成，同是氨基糖苷类抗生素的新霉素和阿米卡星的耐药表型具有显著性差异，孙慧琴等[9]的试验中也出现了相似结果。

为进一步研究为何对同一类的抗生素的敏感度有巨大差异，本试验从分子水平继续研究，对12种耐药基因和6种MGEs进行检测，试验结果显示所有耐药基因均被检出，MGEs中除了tnpU基因外均被检出，这与王卫华等[10]的结果相似。耐药基因中qnrB的检出率最高，为86.21%，其次检出率超过50%的基因还有tetB、sul2和ErmB，分别对应着喹诺酮类、四环素类、磺胺类和大环内酯类抗生素，这四类抗生素的耐药率除喹诺酮类以外均高于平均值35.63%，说明耐药基因在一定程度上可以反应耐药表型的敏感度，但不完全一致，这可能与细菌的多重耐药机制相关，这与刘勃兴等[11]的观点相一致。研究表明，MGEs可能是耐药大肠杆菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类等抗生素耐药的重要原因，这与本试验的结果相似[12]。

本试验发现，携带可移动遗传原件越多的细菌，细菌对抗生素的耐药率越高，这与王雪等[13]的研究结果相类似。但耐药率较高的细菌，其可移动原件的检出率不一定高，这有可能是部分未检测的可移动原件存在于细菌体内，传播耐药性。

吴同垒等[14]研究表明，2017-2018年河北秦皇岛地区的牛源大肠杆菌平均耐药率为29.10%，与本试验结果相近。苑晓萌等[15]研究表明，山东地区的牛源大肠杆菌平均耐药率为16.90%，远低于本试验结果。说明不同地区牛源大肠杆菌的耐药表型相差较大。本试验通过对患有子宫内膜炎奶牛进行了子宫黏液样品的大肠杆菌分离鉴定试验，分析了河北地区牛子宫内大肠杆菌的致病性及其耐药性及耐药基因水平传播情况，为临床防治致病性大肠杆菌所致的奶牛子宫内膜炎提供了依据。