于诗筠，崔鹤馨，文会淇，喻鑫婷，吕金晖，张雅倩，张湘莉兰，崔玉军，米志强*，黄海龙*

(1.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.长春市农业科学院，吉林 长春 130022；3.军事科学院 军事医学研究院 微生物流行病研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071)

随着经济水平与生活质量的提高，猫现今已成为人们首选的伴侣动物之一。猫传染性腹膜炎(FIP)是猫临床常见传染病之一，该病主要由感染猫冠状病毒(FCoV)所导致，具有传染性强、致死率高的特点。据报道，FCoV为单股正链RNA病毒，可分为猫肠道冠状病毒(FECV)与猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)两种[1]。一般来说，绝大多数幼猫接触母体粪便后均有可能感染FECV，临床症状一般表现为轻度腹泻，因而容易被忽视[2]，然而该病毒容易突变为FIPV，导致猫患传染性腹膜炎，从而导致猫死亡[3]。

当前，兽医临床通常使用胶体金快速试纸法及其他传统病原检测法判断猫病毒感染[3]，然而，这些检测方法均存在一定的局限性。胶体金快速试纸法虽然简便快捷，但其灵敏度不高，阳性结果不能说明一定感染了特定病毒[4]。其他传统病原检测法主要分为两类，一类是通过细胞形态学、生理生化特征，以及培养分型识别病原，另一类则是通过特异性引物、探针、抗体等快速检测病原[5]。虽然上述方法在病原检测中具有重要作用，但是也存在一些不足之处。一方面，某些病原体的培养条件要求较高，难以在实验室条件下进行培养。另一方面，基于引物、探针、抗体的检测方法需要完整的病原基因组序列，只能针对已知病原感染。

近年来，随着高通量测序技术的迅猛发展与成本降低，未知病原体感染的检测水平获得极大提高。相对于传统病原检测技术，高通量测序技术不依赖于病原培养与特异性基因序列，可对样本内痕量病原体的核酸进行高通量测序与分析。目前，高通量测序技术包含DNA建库与RNA建库两种方法，尽管基于两种建库方法的高通量测序均能检测到样本中的病原体，但是，由于基于DNA建库的测序技术无法捕捉到无DNA复制周期的RNA病毒，因此，基于RNA建库的测序技术能够检测到更多的病原体。当前，高通量测序技术主要用于鸡、鸭与猪等畜禽动物疫病的流行病学研究，较少用于猫混合病毒感染的检测。

基于此，本研究利用RNA建库技术对1例猫传染性腹膜炎的腹水与血清样本进行了高通量测序，并对所得数据进行分析以判断感染病原，结果提示病猫腹水样本中既携带RNA病毒也携带DNA病毒，包括FIPV(ssRNA)、猫星状病毒(FeAstV，ssRNA)与犬细小病毒(CPV，ssDNA)3种病毒，血清样本中携带FIPV(ssRNA)。总之，本研究不仅证实基于RNA建库的高通量测序技术能够同时检测到RNA与DNA病毒混合感染，而且能够为动物未知病原体感染的检测提供新思路与参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂Qubit 2.0荧光计(赛默飞，美国)；NanoDrop微量分光光度计(赛默飞，美国)；病毒RNA提取试剂盒(罗氏，瑞士)；RNA建库试剂盒(赛默飞，美国)；2100生物分析仪(安捷伦，美国)；高灵敏DNA试剂盒(安捷伦，美国)；Ion GeneStudio S5 Plus测序仪(赛默飞，美国)。

1.2 样本来源与核酸提取所用样本来源于7月龄发病雌猫的腹水与血清，该病猫的主要临床症状为高烧、嗜睡、黄疸、腹围增大、精神沉郁、食欲减退、消瘦。分别取400 μL腹水与血清样本，使用罗氏核酸提取试剂盒提取样本中总RNA并置于-80℃冰箱保存备用。

1.3 cDNA文库的构建与测序使用RNA建库试剂盒构建cDNA文库，具体方法如下：首先，将病毒RNA 随机打断成不同片段，其次，在每个片段末端添加接头(adaptor)，最后，加入逆转录酶，使RNA反转录成cDNA，同时加入不同标签序列(barcode)以区分不同样本。接下来，使用NanoDrop 微量分光光度计对所得cDNA文库进行定量，使用安捷伦2100生物分析仪分析文库片段长度，随后，使用Ion GeneStudio S5 Plus测序仪进行高通量测序。

1.4 数据分析本研究对所得测序数据使用FastP 0.21.0软件(http://github.com)与FastQC软件(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk)进行质控，即筛选碱基正确率为 99.9% 的reads(Q20)。所得质控数据使用kraken2-2.0.7-beta软件(https://ccb.jhu.edu)与minikraken2_v2_8GB_201904_UPDATE数据库(https://ccb.jhu.edu/)，以及Centrifuge-1.0.3-beta软件(https://ccb.jhu.edu)与p_compressed+h+v数据库(https://ccb.jhu.edu)进行物种比对分析，得到检测样本中可能存在的病毒数据，并从NCBI Genome数据库中下载相应病毒的参考序列。然后根据病毒参考序列，使用CLC Genomics Workbench 3.6.1软件[6](https://digitalinsights.qiagen.com)对腹水与血清样本的质控数据进行组装。最后，使用NCBI BLASTn数据库对组装后的reads进行比对与验证。

2 结果

2.1 RNA提取与cDNA文库构建Qubit 2.0荧光计测得腹水与血清样本中提取的总RNA质量浓度分别为11.8,8.0 mg/L，取100 ng RNA用于cDNA文库构建，NanoDrop 微量分光光度计测得腹水cDNA文库浓度为166.7 pmol/L，血清cDNA文库浓度925.8 pmol/L。使用2100生物分析仪测得腹水cDNA文库平均片段长度为320 bp，血清cDNA文库平均片段长度为237 bp，如图1所示。

A.腹水cDNA文库；B.血清cDNA文库。图中箭头所示位置为cDNA文库的片段大小

2.2 测序数据质控腹水与血清cDNA文库经高通量测序分别获得354.5 Mb与1.4 Gb原始数据，经FastP 0.21.0与FastQC软件对所得腹水与血清原始数据质控后分别获得1 323 407条与1 323 407条reads，结果见表1。

表1 测序数据质控

2.3 测序数据分析通过kraken2-2.0.7-beta软件与minikraken2_v2_8GB_201904_UPDATE数据库对所得质控数据进行物种比对分析，腹水样本中可能携带12种病毒，血清样本中可能携带6种病毒。使用Centrifuge-1.0.3-beta软件与p_compressed+h+v数据库对质控数据进行比对分析，发现腹水样本中可能携带10种病毒，血清样本中可能携带10种病毒。从NCBI Genome数据库中下载上述病毒参考序列，使用CLC Genomics Workbench 3.6.1软件对质控数据进行比对与组装，结果见表2与图2。最后，使用NCBI BLASTn数据库对组装后的reads进行比对与验证可得：该病猫腹水样本中携带FIPV(ssRNA)、FeAstV(ssRNA)与CPV(ssDNA)；血清样本中携带FIPV(ssRNA)。

表2 质控数据分析

A.猫腹水测序数据经质控后在FIPV参考序列(NC_002306)上的分布和覆盖度；B.猫腹水测序数据经质控后在FeAstV参考序列(NC_022249)上的分布和覆盖度；C.猫腹水测序数据经质控后在CPV参考序列(NC_001539)上的分布和覆盖度；D.猫血清测序数据经质控后在FIPV参考序列(NC_002306)上的分布和覆盖度

3 讨论

已有病毒的突变与新发病毒的不断出现给动物和人类健康造成极大威胁。猫作为人类首选伴侣动物之一，对其携带的病毒进行监测十分必要。传统病原检测多是基于病原生化特性、胶体金、PCR与ELISA等方法的单病原检测。尽管多重PCR技术与微流控技术进一步提高了检测病原体的种类，但还是无法对样本中携带的全部病原体进行检测，高通量测序技术的出现弥补了这一缺陷。然而，高通量测序技术在未知病原体检测方面的应用同样面临挑战，比如样本中病原体含量过低时无法检出，样本受到环境污染影响测序结果的准确度，测序过程中存在PCR偏向性等问题。此外，部分RNA病毒在复制过程中没有DNA产物，这导致基于DNA建库的高通量测序方法无法获得这些RNA病毒的序列[7]。

所有病原体在复制过程中都会有RNA产生，因此，基于RNA建库的高通量测序技术在理论上能够检测到样本中所有的病原体。与传统病原检测技术相比，该技术灵敏度高，且不依赖于已知基因组序列。本研究利用RNA建库测序技术，通过对病猫腹水与血清样本进行高通量测序与分析，发现腹水样本中携带3种病毒，即FIPV、FeAstV与CPV，血清样本中携带一种病毒FIPV，其中FIPV与FeAstV为单股正链RNA病毒，CPV为单链线状DNA病毒。

FIPV通常由FECV突变而来，具有致死率高、传染性强的特点。FeAstV的致病性尚不明确，因此诊断方法有限[8-9]。目前，部分研究报道可通过RT-PCR检测FeAstV，但可能存在假阳性[10-11]。CPV通常可导致犬急性出血性肠炎、心肌炎等疾病。近年来，由于CPV的基因突变，其宿主范围不断扩大，现已有报道证实，CPV-2a、CPV-2b与CPV-2c亚型可感染猫科动物，其症状与猫泛白细胞减少症相似[12]。目前，兽医临床常用胶体金快速试纸法检测犬感染CPV，但是 ，该方法同样存在假阳性。此外，由于猫感染CPV的症状与猫泛白细胞减少症相似，故极易导致误诊[13-14]。FeAstV与CPV通常不能引起猫腹水，但是，当哺乳动物机体免疫功能降低时，星状病毒属能够破坏肠道上皮屏障，致使其他组织器官感染[15-17]， 而CPV可以侵害淋巴组织、骨髓与肠黏膜，造成全身感染[18]。

本研究通过RNA建库测序能够同时检测到猫腹水样本中的RNA病毒与DNA病毒。该技术不仅在未知病原体检测中发挥了重要作用，而且也为分析细胞转录水平的调控提供了有效手段[19]，此外，该测序技术还可以用于监测病毒突变，对于传染病的防控具有重要意义。