赵红宇，景志刚，周盛华，关文凤，王春柳

（1. 黑龙江康普生物科技有限公司，黑龙江哈尔滨 150025；2. 黑龙江省牛初乳工程技术研究中心，黑龙江 哈尔滨 150025）

0 引言

糙米中含有蛋白质、矿物质、谷维素、维生素、谷固醇、碳水化合物及丰富的膳食纤维[1]。相较于经打磨去掉米糠层及胚后的普通精米，糙米保留了绝大部分膳食纤维、维生素[2]。同时，发芽糙米有较好的医疗保健效果，对Ⅱ型糖尿病、老年痴呆、高血脂及癌症有较好的预防作用。其市场开发潜力巨大，比糙米拥有更多营养成分，都是市售精米无法比拟的，由于糙米中存在抗营养因子——植酸，抗营养因子可以和人体体细胞表层的糖蛋白和低聚糖进行结合，还可以与红细胞发生凝结作用，抑制人体对糙米中营养成分的消化吸收，因此糙米并未体现出比普通精米更高的营养价值[3]。

目前发现，热处理可以降低块茎类食品中植酸的含量，但对谷类和豆类食品则没有效果。Michal M等人[4]发现在食品加工过程中，植酸在长时间高温下可能发生降解。Anuttam P[5]发现在147 ℃下烘烤15 min对于植酸含量可以起到显著降低的作用（p=0.05），由此可见，热处理具有降低植酸抗营养作用，但其最终降低效果还有待进一步研究及证实。植酸的化学降解也可以通过控制pH 值来实现，溶液pH 值在4.5～5.5 时，大豆中的植酸可以被降解，此时大豆蛋白的溶解度最低为35%～75%[6]。此外，随着科技迅猛发展通过基因克隆生产出具有植酸酶的基因，利用重组表达技术将植酸酶基因转移到植物中成为近年来的研究热点[7]。

外源酶制剂的引入不仅可以补充和维持动物体内的酶活性，还可以保障营养的利用率，并且能够灭活食物中的部分抗营养因子[8]。对于弘扬中国传统饮食文化、建立和谐的饮食结构、开发环境友好型食品资源具有重要意义。同时，也可以为糙米及其制品的科学消费提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

次氯酸钠（NaClO），山东力昂新材料科技有限公司提供；蒸馏水（H2O）、植酸（C6H18O24P6），南京都莱生物技术有限公司提供；氯化铁（FeCl3）、磺基水杨酸（C7H6O6S）、氯化氢（HCl）、硫酸钠（Na2SO4）、氢氧化钠（NaOH）、冰乙酸、纤维素酶（U）、果胶酶（U）。

JA1003 型电子分析天平，广西顺德电器有限公司产品；LC-LX-HL210D 型台式高速离心机，山东亿伟安化工科技有限公司产品；DHG-9203A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海伟安化学试剂器械厂产品；1 000 μL 微量可调移液器，上海雷磁有限公司产品；HH-2 型恒温水浴锅，上海力辰仪器科技有限公司产品；PHS-25 型pH 计，山东亿伟安化工科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的测定

取8 支试管，分别加入质量浓度为0.1 g/L 的植酸标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，加蒸馏水至3 mL，再加0.03% FeCl3·6H2O 0.3%磺基水杨酸1 mL，摇匀待测。蒸馏水调零，于波长500 nm处测吸光度。以标准溶液中的植酸含量（μg/3mL）为横坐标、吸光度为纵坐标，制作标准曲线。

根据公式：

式中：X——样品中植酸的含量，g/100 g。

1.2.2 不同酶解温度对发芽糙米的植酸含量影响

选取发芽糙米2 g 用粉碎机打成粉末状进行试验，酶解时间60 min，溶液pH 值为4，酶用量5 mL，分别控制酶解温度为27，37，47，57，67 ℃，以发芽糙米植酸含量为考查指标。

1.2.3 不同酶解时间对发芽糙米的植酸含量影响

选取发芽糙米2 g 用粉碎机打成粉末状进行试验，酶解温度47 ℃，溶液pH 值为4，酶用量5 mL，确定酶解时间为15，30，60，90，120 min，采用发芽糙米植酸含量为考查指标。

1.2.4 不同pH 值对发芽糙米的植酸含量影响

选取发芽糙米2 g 用粉碎机打成粉末状进行试验，酶解温度47 ℃，酶解时间60 min，酶用量5 mL，分别控制溶液pH 值为2，3，4，5，6，以发芽糙米植酸含量为考查指标。

1.2.5 不同加酶量对发芽糙米中植酸含量的影响

选取发芽糙米2 g 用粉碎机打成粉末状进行试验，酶解温度47 ℃，酶解时间60 min，溶液pH 值为4，纤维素酶与果胶酶按体积比1∶1 进行配置分别控制酶用量为1，2，5，10，15 mL，以发芽糙米植酸含量为考查指标。

1.2.6 响应曲面试验设计

采用Box-behnken 试验原理，单因素试验情况为依据，选出对发芽糙米植酸含量显著的3 个影响因素包括酶解温度（A）、溶液pH 值（B）、酶用量（C） 进行17 个试验点的响应曲面分析试验。

响应面试验设计见表1。

表1 响应面试验设计

1.2.7 样品中植酸的提取

取样品0.75 g，加入1.2%HCl 10%Na2SO4溶液30 mL，室温下搅拌2 h，以转速4 500 r/min 离心30 min，得到上清液，于4 ℃冰箱中保存。

1.2.8 样品中植酸的测定

取上清液5 mL、15%三氯乙酸（TCA） 5 mL 于离心管中，混匀，4 ℃冰箱中静置2 h，然后以转速4 500 r/min 离心30 min。取上清液5 mL，用0.75%NaOH 调节其pH 值至6.2 左右，加水至75 mL，混和均匀，取3 mL 稀释液，加入0.03%FeCl3·6H2O 0.3%磺基水杨酸1 mL，混匀后于波长500 nm 处比色测定。其计算方法同1.2.1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的测定

植酸标准曲线见图1。

图1 植酸标准曲线

2.2 不同酶解温度对发芽糙米植酸含量的影响

不同酶解温度对发芽糙米植酸含量的影响见图2。

由图2 可知，随着酶解温度的升高，发芽糙米的植酸含量呈先降低后趋于平稳波动性变化，在47 ℃左右发芽糙米中植酸含量存在最小值，其次温度的继续升高，植酸含量接近于平稳有小幅增加。主要原因是由于反应进行，温度逐渐上升，超过纤维素酶和果胶酶的最适温度，对复合酶的抑制作用增强，即不能完全酶解发芽糙米中的植酸。综合考虑，酶解温度在47 ℃为宜。

图2 不同酶解温度对发芽糙米植酸含量的影响

2.3 不同pH 值对发芽糙米植酸含量的影响

不同pH 值对发芽糙米植酸含量的影响见图3。

图3 不同pH 值对发芽糙米植酸含量的影响

酶解pH 值为2～3 时，植酸含量有所下降。随着pH 值逐渐增加，酶解率也逐渐提升，植酸含量逐渐减少。所以最适pH 值应该在5 左右，此时其生长环境为偏酸性，出现植酸含量的最低值。pH 值过低或过高都不利于复合酶酶解反应的进行，阻碍酶促反应速率。因此，利用复合酶进行反应时应注重pH 值的调节。综合考虑，pH 值在5 为宜。

2.4 不同酶用量对发芽糙米植酸含量的影响

不同酶用量对发芽糙米植酸含量的影响见图4。

图4 不同酶用量对发芽糙米植酸含量的影响

由图4 可知，随着酶用量增加，植酸含量逐渐降低。但当酶用量为5 mL 左右时，植酸含量逐渐呈现平缓趋势，不再下降。为不浪费酶液的使用，有利于酶解反应的进行，当复合酶用量为5 mL时，植酸含量达到最低。随着加酶量的增多，发芽糙米中植酸含量略有浮动，之后植酸含量基本为持平状态。略有小幅度上升趋势，不再呈现下降趋势。综合考虑，加酶量在5 mL 为宜。

2.5 不同酶解时间对发芽糙米植酸含量的影响

不同酶解时间对发芽糙米植酸含量的影响见图5。

图5 不同酶解时间对发芽糙米植酸含量的影响

酶解时间也会进一步影响到发芽糙米中植酸的含量。酶解时间延长，发芽糙米中植酸含量逐渐呈现下降趋势，但当酶解时间在60 min 左右时，出现一个植酸含量的最低值。说明此酶解时间适合复合酶的酶解反应，可有效促进发芽糙米中植酸的分解。随着时间的持续增长植酸含量不再出现变化。时间过长对植酸分解反应试验并未起到促进作用，反之时间过短则使复合酶分解植酸的反应进行不完全，因此时间过长或过短都不利于酶解反应的进行。综合考虑，酶解反应最适时间约为60 min。

2.6 响应曲面试验结果

根据各因素对发芽糙米中植酸含量影响的重要程度，选取对植酸含量影响较高的3 个重要因素酶解温度、pH 值及酶用量进行响应面试验，在酶解温度为47 ℃，pH 值为5，酶用量为5 mL 条件的左右位置两侧，设置一个对比试验点，进行响应面试验操作，其中控制酶解时间为60 min 不变。采用Box-behnken 设计对外源酶降解发芽糙米中植酸的条件进行优化。

响应曲面试验设计方案及结果见表2。

2.6.1 响应面分析数学模型的建立

针对表2 中的试验数据，在对其响应面进行回归分析时，可以发挥Design Expert 8.0[9]软件优势，得到试验的回归模型方程为：

回归及方差分析见表3。

2.6.2 各因素影响程度分析

由表3 可知，二次回归模型的方差分析该模型，失拟项p=0.103 5＞0.05，说明模型预测值与实际误差值较小，模型的拟合程度良好，未知因素对试验结果干扰很小。3 个因素的p 值均＜0.01，表明酶解温度、pH 值及酶用量均是影响外源酶降解发芽糙米中植酸含量的重要因素[9]。判断这些因素同试验指标的关联程度[10]，以其本身所有的F值为依据，数据结果越大，则表明对试验指标的影响越大。从方差分析结果可知，F（A）=9.21，F（B）=0.56，F（C）=11.25，在所选的各因素水平范围内，对响应值的影响排序为C＞A＞B，进一步证明该回归方程在分析外源酶对发芽糙米中植酸含量的影响具有一定的优势[11]。根据表2可知，在回归方程中，交互项显著的存在于其所具有的一次项A，B，C自变量参数，及二次项A2，B2，C2自变量参数当中，从而说明外源酶降低发芽糙米中植酸含量会受到3种因素的显著性影响，同时3种因素之间也呈现一定的交互特征。

表2 响应曲面试验设计方案及结果

2.6.3响应面分析

响应面分析利用Design Expert软件对表2数据进行二次多元回归拟合，二次模型所得到的等高线及响应曲面3D效果。

pH值和酶用量对发芽糙米中植酸含量影响的等高线和响应曲面见图6，酶用量和酶解温度对发芽糙米中植酸含量影响的等高线和响应曲面见图7，酶解温度和pH值对发芽糙米中植酸含量影响的等高线和响应曲面见图8。

图6 pH值和酶用量对发芽糙米中植酸含量影响的等高线和响应曲面

图7 酶用量和酶解温度对发芽糙米中植酸含量影响的等高线和响应曲面

根据二次模型所得到的等高线及响应曲面可以评价试验因素之间的交互作用强度，以及确定各因素的最佳水平范围。在分析交互作用时，AC组的p值最小且小于0.01，说明AC对发芽糙米中植酸含量的降解发挥作用极显著。

由图6可知，当酶用量不变时，随着pH值的升高，曲线走势较为平缓；当pH值不变时，酶用量增加，发芽糙米中植酸含量先减少后增多，结合方差分析说明，酶用量和温度交互作用较为显著。由图7可知，当酶用量稳定时，酶解温度增加发芽糙米中植酸含量呈先减少后增多趋势；当酶解温度稳定不变时，随酶用量增加，发芽糙米中植酸含量呈逐渐减少后增多的相同趋势；结合方差分析结果，酶解温度和酶用量间交互作用显著。由图8 可知，当pH值不变时，随酶解温度升高，发芽糙米中植酸含量呈先减少后增多趋势；当酶解温度不变时，pH 值增加，降解率缓缓增加，曲线很平缓，结合方差分析说明温度和接种量交互作用不显著。由各因素交互作用影响发芽糙米中植酸含量的等高线图和曲面图可知，当各因素的值处于中等水平时，曲面中心区域的发芽糙米中植酸含量较少，并存在极低点。

图8 酶解温度和pH 值对发芽糙米中植酸含量影响的等高线和响应曲面

借助Design Expert 8.0 软件，为验证外源酶对发芽糙米中植酸含量影响的响应模型的准确性和可靠性，在最佳条件下，进行3 次平行试验验证。考虑试验的实际情况，经过对所得回归方程取一阶偏导等于0，得知A=45.57，B=4.90，C=6.05 为最佳组合，在此最优组合中，理论植酸含量为0.259±0.22 g/100 g。接近预测的理论值，表明该数学模型对外源酶降解发芽糙米植酸含量的优化工艺可行。综合考虑理论数值和实际应用性，外源酶降解发芽糙米植酸最佳条件为酶解温度46 ℃，pH 值4.90，酶用量6.05 mL。

2.7 外源酶对发芽糙米植酸降解率结果

采用分光光度法测定酶解后发芽糙米中植酸含量。采用响应面优化试验最佳条件处理发芽糙米中植酸含量变化情况。

酶解后发芽糙米中植酸含量变化情况见表3。

由表3 计算出经优化植酸降解条件后，采用果胶酶和纤维素酶混合处理后糙米中植酸含量降解率为58.89%。

表3 酶解后发芽糙米中植酸含量变化情况/g·（100 g）-1

3 结论

采用分光光度法、单因素试验、响应曲面法等方法，添加外源酶，并对外源酶降解植酸条件进行优化分析，得到主要结论如下：单因素试验结果外源酶降解发芽糙米中植酸的最佳条件为酶解温度47 ℃，pH 值5，酶用量5 mL，酶解时间1 h。响应面试验中确定3 个重要因素，经Design Expert 8.0 软件响应面分析优化，模型拟合性良好，外源酶降解发芽糙米中植酸含量的最理想降解条件为酶解温度46 ℃，pH 值4.90，酶用量6.05 mL。在此条件下进行试验，酶解时间1 h，此时发芽糙米中植酸含量酶解率最高，为58.89%。