鸡源卷曲乳杆菌Y68的分离鉴定及其体外益生特性评估

2022-06-10张家宝刘真真蔺小奇杨勇军

动物营养学报 2022年5期

张家宝马轲刘真真高宇蔺小奇杨勇军

(吉林大学动物医学学院，长春130062)

动物消化道微生物种群是影响宿主机体健康的主要因素[1]。肠道菌群种类繁多，作为胃肠道内庞大的生态系统，对宿主机体生理机能具有极其复杂的影响[2]。乳酸菌作为肠道常驻优势菌[3]，在动物体内可促进免疫器官发育[4]、调节宿主生理机能[5]、增强对肠道病原菌抵抗[6]等，是一种重要的益生菌。

在“无抗”背景下，为防控沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌引起的感染，对于畜禽养殖需要选择抗生素的替代品[3]。畜禽饲粮中添加微生态制剂可促进胃肠道益生菌群繁殖、抑制病原菌群繁殖，发挥其有益的免疫调节特性[7]。筛选对胃肠道环境以及肠道免疫系统具有良好耐受性的益生菌，利用益生菌抑制肠道致病菌且分泌多种消化酶以及细菌素等基本生物学特性，开发畜禽微生态制剂对于改善畜禽营养健康状况及生产性能具有重大意义。

本研究从健康鸡肠道内分离出对于鸡白痢沙门氏菌ATCC19945以及金黄色葡萄球菌USA300具有强抑菌活性的共生菌。研究其种属特征、生长特性、产酸能力、抗生素敏感性、耐受特性、自聚集能力以及疏水性能等益生特性，为畜禽微生态制剂的研发和应用奠定基础理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金黄色葡萄球菌USA300(StaphylococcusaureusUSA300 TCH1516)由吉林大学动物医学学院韩文瑜教授惠赠，鸡白痢沙门氏菌ATCC19945(SalmonellapullorumATCC19945)由中国农业科学院上海兽医研究所韩先干研究员惠赠。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离

取健康鸡盲肠，采用无菌生理盐水清理鸡肠道，用手术刀轻柔刮去肠内容物，换刀继续刮取肠黏膜，取1 g黏膜附属物样品稀释于9 mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀。从样品悬浊液中取1 mL用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer,PBS)稀释至10-5、10-6、10-7，分别取100 μL样品悬浊液于无菌乳酸细菌培养基(MRS培养基，HB0384-1)琼脂板中均匀涂布，置于厌氧培养箱(37 ℃)中培养[8]。24 h后挑取中等大小、微白色、高圆隆、边缘整齐等典型乳酸菌特征的单菌落，连续平板划线传代纯化，直至平板上菌落形态单一。挑取单一菌落接种于MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h，再以1%(v/v)接种量转接进行2次活化，对传代培养后的菌株进行富集并编号，与25%(v/v)甘油混合冷冻保存，以保证后续试验中菌株的稳定可获得性。

1.2.2 牛津杯琼脂扩散法复筛

将对数生长期的金黄色葡萄球菌USA300和鸡白痢沙门氏菌ATCC19945分别接种于胰酪大豆胨液体培养基(TSB培养基，HB4114)、肉汤液体培养基(LB培养基)中，37 ℃，200 r/min振荡培养至细菌对数生长期，用PBS洗涤2次，将细菌悬液浓度调至1×109CFU/mL作为指示菌液。将纯化得到的13株菌株传代培养2代稳定后，MRS液体培养基中进行二级活化，37 ℃厌氧培养48 h，离心(8 000×g, 10 min, 4 ℃)收集上清液。采用牛津杯琼脂扩散法进行抑菌作用筛选[9]，在表面分别涂有50 μL上述2种病原指示菌液的TSB、LB琼脂板上等距放置牛津杯，加入各无细胞发酵上清液200 μL/孔，每组重复3次，37 ℃静置培养16 h，游标卡尺测定抑菌圈直径。

1.2.3 16S rRNA鉴定

选择经筛选抑菌效果最强的菌株Y68送往吉林省库美生物科技有限公司进行16S rRNA测序；所得序列通过NCBI blast，与GenBank数据库中已知菌株序列进行细菌同源性比对，应用软件MEGA 7.0构建系统发育树[10]，确定菌株种属。

1.2.4 生长曲线及菌液pH变化测定

挑取Y68单菌落接种于MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养箱进行一级种子液活化。调整种子液600 nm吸光度(OD600 nm)值为1，按1%(v/v)转接至MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养箱静置培养。监测72 h内细菌悬液的pH和OD600 nm值变化并绘制变化曲线。

1.2.5 抗生素敏感性试验

活化2代后Y68菌株接种至MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养至对数生长期，离心收集菌体(8 000×g，5 min)，PBS重悬洗涤2次，将Y68调整至1×109CFU/mL，50 μL菌液涂布平板，夹取药敏纸片平放置于含菌平板上，每个纸片的间距不小于24 mm[11]，37 ℃厌氧培养24 h，观察并测量Y68抑菌圈直径，参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的纸片扩散法标准进行判定。

1.2.6 酸耐受试验

酸耐受试验按照Ahire等[12]描述的方法测定。参照1.2.5制备分离株Y68细菌悬液，将100 μL细菌悬液分别与900 μL PBS(pH为2.0、3.0、4.0、7.4)混合，37 ℃厌氧培养箱孵育3 h。取经处理0、3 h的菌液进行稀释涂布平板法检测活菌数，通过孵育后MRS琼脂平板上菌落数计算其存活率，菌落数以每毫升菌落形成单位的lg值[lg(CFU/mL)]表示。

存活率(%)=100×最终值[lg(CFU/mL)]/
初始值[lg(CFU/mL)]。

1.2.7 肠液、胃液耐受试验

参考《中国药典》2010版配制人工胃液、人工肠液，并用0.22 μm微孔无菌滤膜(水系)过滤备用。采用Sornsenee等[13]描述的体外模拟胃肠道耐受试验方法进行。Y68细菌悬液按1∶10分别稀释于模拟人工胃液、肠液中，37 ℃厌氧培养箱分别孵育3、10 h，以满足胃蛋白酶以及胰酶耐受条件。分别取经人工胃液孵育0、3 h，人工肠液孵育0、4和10 h菌液通过稀释涂布平板法，计算细菌存活率，菌落数以lg(CFU/mL)表示。

1.2.8 胆盐耐受试验

根据Chen等[14]的胆汁耐受性试验方法，Y68细菌悬液在添加胆汁(质量体积比分别为0、0.1%、0.3%、0.5%)的MRS肉汤中1∶10稀释，37 ℃厌氧培养箱孵育4 h。取经处理0、4 h的菌液计算细菌存活率，每个时间点取3个重复。

1.2.9 细菌自凝集试验

根据Del Re等[15]细菌自凝集试验方法，将细菌悬液用PBS稀释至OD600 nm值=0.5，置于37 ℃厌氧环境下静置孵育，分别收取0、2、4、12和24 h上清液，测定OD600 nm值。自聚集率的计算公式如下：

自聚集率(%)=[1-(Atime/A0)]×100。

式中：Atime为特定时间的吸光度；A0为0 h的吸光度。

1.2.10 细菌疏水性试验

参照Sornsenee等[13]二甲苯萃取法测定菌株的疏水性。将菌体在OD600 nm值=0.5的PBS中重悬制得细菌悬液。取2 mL细菌悬液与1 mL二甲苯混合，在37 ℃厌氧培养箱中静置孵育30 min以分离水相和有机相。孵育后测量水相的OD600 nm值。疏水率采用如下公式计算：

疏水率(%)=[(A0-A)/A0]×100。

式中：A0和A是二甲苯萃取前后测定的吸光度值。

1.3 统计学分析

试验数据使用Graphpad Prism 7.0软件进行分析，以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 分离筛选结果

从鸡盲肠壁分离得到13株共生菌，以培养48 h的共生菌为研究对象，以鸡白痢沙门氏菌ATCC19945和金黄色葡萄球菌USA300为指示菌进行抑菌作用筛查，由图1抑菌试验结果可知，有3株共生菌发酵上清液对2种指示菌均有较强抑菌作用，编号分别为Y14、Y68、Y187。其中Y68菌株对鸡白痢沙门氏菌ATCC19945抑菌圈直径为(21.64±0.31) mm，对金黄色葡萄球菌USA300抑菌圈直径为(15.13±0.23) mm。

A: 13株共生菌培养物对鸡白痢沙门氏菌ATCC19945抑菌效果评价；B:13株共生菌培养物对金黄色葡萄球菌USA300抑菌效果评价；C:Y14、Y68、Y187抑菌效果图。

2.2 菌种鉴定结果

将获得的菌株Y68的16S rRNA序列通过NCBI blast进行比对分析，结果显示它和卷曲乳杆菌ATCC33820序列比对结果相似度为100%。通过MEGA 7.0软件的Neighboring-joining方法构建系统发育树(图2)，并将测序结果与同源性相近的菌株进行多重序列比较，通过亲缘关系进一步确定菌株Y68为乳杆菌属的卷曲乳杆菌。

Lactobacillus acidophilus strain NBRC 13951：嗜酸乳杆菌NBRC 13951；Lactobacillus helveticus strain NBRC 15019：瑞士乳杆菌NBRC 15019；Lactobacillus ultunensis strain CCUG 48460：厄尔纳拉乳杆菌CCUG 48460：厄尔纳拉乳杆菌CCUG 48460；Lactobacillus kefiranofaciens strain LMG 19149：马乳酒样乳杆菌LMG 19149；Lactobacillus kitasatonis strain JCM 1039：卡氏乳杆菌JCM 1039；Lactobacillus amylovorus strain DSM 20531：噬淀粉乳杆菌DSM 20531；Lactobacillus crispatus strain ATCC 33820：卷曲乳杆菌ATCC 33820；Lactobacillus hamster strain DSM 5661：仓鼠乳杆菌DSM 5661；Lactobacillus kullabergensis strain Biut2N：库拉堡乳杆菌Biut2N。

2.3 生长曲线及菌液pH

卷曲乳杆菌Y68对数生长期为6～24 h，稳定期为24～60 h，60 h后进入衰亡期(图3)。菌液pH在0～24 h内下降速度较快，在24～48 h菌液pH下降速度减慢，48 h后菌液pH稳定在3.89(图3)，Y68表现出较强的产酸能力。

图3 卷曲乳杆菌Y68生长曲线及发酵液pH变化

2.4 抗生素敏感性试验结果

如表1所示，Y68对所检测的β-内酰胺类抗生素(青霉素、头孢菌素)、大环内酯类抗生素(红霉素、麦迪霉素)、酰胺醇类(氯霉素)、半合成衍生物(克林霉素)、糖肽类抗生素(万古霉素)较为敏感，对所检测的四环素、喹诺酮类抗生素(诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星)、氨基糖苷类抗生素(庆大霉素、卡那霉素)以及呋喃唑酮均表现出耐药。

表1 卷曲乳杆菌Y68抗生素敏感试验结果

2.5 卷曲乳杆菌Y68在体外模拟胃肠道条件下的存活率

卷曲乳杆菌Y68的酸耐受结果如图4-A所示。卷曲乳杆菌Y68在pH 2.0环境下孵育3 h后存活率从83.07%下降至52.61%，仍具有较高的存活率；在pH 3.0环境中分别孵育0、3 h后，存活率分别为94.07%和90.92%；在pH 4.0环境中分别孵育0、3 h后，存活率分别为99.29%和92.60%。

在人工胃液中，卷曲乳杆菌Y68的菌落数在3 h后从8.87 lg (CFU/mL)(0 h)下降到5.84 lg (CFU/mL)(3 h)，存活率为65.92%(图3-B)。在人工胃液中培养4 h后，未检测到细菌存活(图4-B)。在人工肠液中，4 h时卷曲乳杆菌Y68的存活率为93.19%(图4-B)，10 h时存活率为86.23%(图4-B)。

A：卷曲乳杆菌Y68酸耐受能力；B：卷曲乳杆菌Y68胃肠液耐受能力；C：卷曲乳杆菌Y68胆盐耐受能力。

在胆盐耐受试验中(图4-C)，卷曲乳杆菌Y68在0.1%(w/v)胆盐环境中菌落数为7.89 lg (CFU/mL)，存活率为94.95%；0.3%(w/v)胆盐环境中菌落数为6.39 lg (CFU/mL)，存活率为76.94%；0.5%(w/v)胆盐环境中菌落数为4.83 lg ( CFU/mL)，存活率为58.14%。

2.6 细菌自凝集以及疏水性试验结果

卷曲乳杆菌Y68的自聚集率如图5所示，在37 ℃厌氧环境下卷曲乳杆菌Y68具有较强的自聚集能力，2 h时自聚集率为(29.71±0.40)%，4 h自聚集率为(66.23±0.56)%，12 h自聚集率为(95.04±0.16)%，24 h时自聚集率为(97.23±0.76)%。经细菌疏水性检测，计算得到卷曲乳杆菌Y68的疏水率为(89.59±0.63)%。

图5 卷曲乳杆菌Y68自聚集率

3 讨论

卷曲乳杆菌作为健康女性阴道微生物组中的优势菌群，常见定植于人类阴道中，另外也发现可定植于人的口腔和肠道[16]，以及鸡的肠道和嗉囊等部位[17]。卷曲乳杆菌可调节宿主免疫系统[18]、减轻小鼠过敏症状[19]、下调癌基因表达以及抑制癌细胞增殖[20]以及产生各种抗菌物质[21]，而被认为具有很大的开发为畜禽微生态制剂的潜力。

抗菌活性被认为是益生菌菌株筛选的一项重要标准。Wang等[22]发现从阴道分离的卷曲乳杆菌产生的抗菌化合物能够强烈抑制白色念珠菌的生长、菌丝形成并调节毒力相关基因表达。Lee等[23]发现卷曲乳杆菌可以拮抗结核分枝杆菌。而Scillato等[21]发现，从人阴道分离的卷曲乳杆菌对包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌等在内的多种病原菌，均有较强的抗菌活性。本研究从鸡盲肠壁分离的1株卷曲乳杆菌Y68，显示出对鸡白痢沙门氏菌ATCC19945和金黄色葡萄球菌USA300较强的抑菌活性。因此，本试验分离得到的卷曲乳杆菌Y68具备开发为新型畜禽微生态制剂的首要前提。

益生菌进入肠道后，通常需要快速定植并迅速生长，从而在微生物竞争中获得优势，成为优势菌群[6]。本试验中，卷曲乳杆菌Y68培养6 h进入对数生长期，24 h进入稳定生长期，具备快速生长能力，在厌氧培养发酵后培养上清pH可以降至3.9左右，充分说明卷曲乳杆菌Y68良好的生长特性及较强的产酸能力。

益生菌通常含有一些抗性基因，但一般被认为是无害的。抗生素敏感性试验表明，卷曲乳杆菌Y68对红霉素、麦迪霉素、青霉素、头孢菌素、氯霉素、万古霉素、克林霉素较为敏感，对诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、四环素、庆大霉素、卡那霉素以及呋喃唑酮表现出耐药。有研究认为，氨基糖苷类抗生素抗性基因(如庆大霉素、卡那霉素)在卷曲乳杆菌中是普遍存在的，不太可能以菌株特异性方式发挥作用[16]。而对四环素表现出耐药，几乎是所有乳酸菌都具有的[24]。卷曲乳杆菌Y68耐药基因还需从基因组水平进一步确定，从而为临床应用提供更加有效的支撑。

益生菌进入肠道定植，需耐受胃肠道的特殊环境，而这也被认为是益生菌应当具备的关键特性[25]。因此，体外模拟胃肠道环境，评估菌株的耐受特性是评价益生菌功能的重要指标。本试验中，卷曲乳杆菌Y68在pH 3.0环境下存活率高达90.92%，而在pH 2.0环境下存活率仍达52.61%，在模拟胃液中存活率为65.92%，模拟肠液中处理4 h时存活率达93.19%，充分说明其可以耐受胃肠道环境。动物肠道不同部位含有一定量的胆盐，浓度通常在0.03%～0.50%波动，因此，对胆盐耐受有利于益生菌在宿主肠道定植[26]。卷曲乳杆菌Y68在0.5%(w/v)胆盐环境中存活率达58.14%，说明具有良好的耐受胆盐的能力。对胃肠道环境较强的耐受特性，进一步表明卷曲乳杆菌Y68具备开发为畜禽微生态制剂的潜在条件。

益生菌突破胃肠道环境后，在肠道增殖及发挥功能，需要具备对肠上皮细胞或肠黏膜表面较强的黏附特性，因此，黏附能力成为筛选益生菌的重要标准之一[27]。益生菌的自聚集能力和疏水能力被广泛地用于评价益生菌黏附性[28-29]。有研究发现，卷曲乳杆菌对宿主细胞的黏附性与自聚集能力存在关系，且自聚集能力强的卷曲乳杆菌对黏液或Caco2细胞的黏附性更好[30]。另外，有研究同样发现，在小鼠体内自聚集特性也可以增强卷曲乳杆菌的肠道定植[31]。本试验发现，卷曲乳杆菌Y68也具有较强的自聚集能力，表明卷曲乳杆菌Y68具有对肠道强黏附的潜力，具有可促进形成胃肠道防御屏障的潜能。