曹瑶瑶，李 霞，白军朋，徐 蔚，倪 盈，董 创，仲红丽，李 斌*

1.天津理工大学机械工程学院，天津 300384 2.北京农业智能装备技术研究中心，北京 100097 3.北京市可持续发展科技促进中心，北京 100101 4.国家农业智能装备工程技术研究中心，北京 100097 5.山东省菏泽市巨野县林业局，山东 菏泽 274000

引 言

培氟沙星(Pefloxacin)、氟罗沙星(Fleroxacin)是两种常用的喹诺酮类抗生素，因为杀菌性强、高效快速，被广泛应用于家禽家畜，预防疾病和促进动物生长[1-2]。然而，过量使用抗生素使得动物体内抗生素含量超标，进而通过食物链进入到人的体内，引起耐药性，影响人体健康。国家农业部2015年第2292号公告规定在动物食品中禁止使用培氟沙星等抗生素[3]。因此，对这两种抗生素残留进行有效监控非常重要。农业部2349号公告规定饲料中喹诺酮类抗生素的标准检测方法为液相色谱串联质谱法[4]。常用的抗生素检测方法还有高效液相色谱法、免疫化学法、酶联免疫法、毛细管电泳法等[5]。这些方法检测精度较高，但需要专业人员进行操作，且需要复杂的预处理。快速、高效的检测方法成为一种需求。

太赫兹波是指频率范围为0.1～10 THz，波长为0.03～3 mm的电磁波，介于微波与红外波之间，能够穿透大分子物质，得到其物理和化学信息[6]。相关研究人员利用太赫兹技术对不同的抗生素进行了研究。徐贤海、朱思原、戴浩等[7-9]先后对β-内酞胺类抗生素进行了检测，结果显示β-内酞胺类抗生素在太赫兹波段存在特征吸收峰。有报道对14种头孢类抗生素进行了研究，其中8种存在吸收峰，其余6种可以通过折射率将它们区分出来。Albert Redo-Sanchez和Qin等[10-11]对四环素和人工合成抗生素进行研究，发现与不同基质混合后，仍然可以检测到抗生素。Long等[12]利用太赫兹技术对鱼粉中的诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星进行了定性定量分析，其中氧氟沙星的最优相关系数达到0.964。有研究利用太赫兹光谱技术对高浓度和低浓度的诺氟沙星初步开展了定量分析。在利用太赫兹光谱技术对培氟沙星和氟罗沙星抗生素进行定性定量研究方面尚未见报道。

为探索上述两种抗生素的太赫兹波段吸收特性和定性定量检测方法，本研究选取培氟沙星和氟罗沙星该两种抗生素为研究对象，利用太赫兹时域光谱(THz-TDS)开展测试研究。研究实验流程如图1所示，包括：(1)制备培氟沙星、氟罗沙星、聚乙烯(PE)、鱼粉纯净物以及培氟沙星-鱼粉、氟罗沙星-鱼粉17种不同浓度二元混合物的压片样品；(2)得到所有样品的太赫兹光谱数据，并分析其太赫兹光谱特性；(3)利用连续投影算法(successive projections algorithm，SPA)选取特征频率，基于特征频率处的吸收系数建立支持向量机(support vector machine，SVM)和反向传播神经网络(back propagation neural network，BPNN)分类判别模型，选出分类结果最优模型；(4)利用特征频率处吸收系数建立偏最小二乘回归(partial least squares regression，PLSR)、BPNN和多元线性回归(multiple linear regression，MLR)定量回归模型，通过比较几种模型的预测结果，选出最佳预测模型。

图1 实验流程图

1 实验部分

使用太赫兹时域光谱仪(TERA K15，德国Menlo System公司)进行光谱测量，飞秒激光中心波长为1 550 nm，重复频率为100 MHZ，脉宽小于90 fs；使用手动压片机(Specac GS15011，英国)压片；使用精密电子天平(FA2004N，上海菁海仪器有限公司)称量。

培氟沙星(CAS: 149676-40-4，纯度为99%)和氟罗沙星(CAS: 79660-72-3，纯度为98%)由上海麦克林生化科技有限公司购买；鱼粉由当地超市购买，经检测无抗生素残留；聚乙烯粉末(CAS 9002-88-4，粒度40～48 μm)由西格玛-奥尔德里奇公司购买。

1.1 样品

样品制备流程为：(1)研磨：将粉末样品置于玛瑙研钵中充分研磨；(2)称量：使用精密电子天平按照不同浓度依次称量样品，每个压片质量约200 mg，并将混合物搅拌均匀；(3)制片：在3.5 t外力，3 min固片条件下，运用压片机依次制备压片，压片直径为13 mm，厚度为1～2 mm。样品制备信息如表1所示。

表1 实验样品制备信息

1.2 数据采集

测量实验在透射模式下进行，同时充入氮气进行干燥，使测试环境相对湿度低于3%，排除空气中水分影响。每个样品在不同部位重复测量3次。运用自带软件TeraMat_v10.vi计算频谱和吸收系数。

利用多项式平滑(Savitzky-Golay，SG)算法对原始数据进行预处理，选择平滑窗口宽度为5，多项式次数为2。利用连续投影算法(successive projections algorithm，SPA)来选取特征频率以减少冗余信息。

1.3 模型建立及评价

支持向量机(SVM)是一种适合于非线性、小样本的分类算法，其分类原理是找到一个超平面使得其两侧样本距离最大。反向传播神经网络(BPNN)不仅可以实现分类，还可以进行回归分析，其输出结果前向传播，误差采用反向传播。偏最小二乘回归(PLSR)是一种常用回归方法，可以较好地解决自变量存在的严重多重相关性问题[13]。多元线性回归(MLR)算法能线性表示输入变量与输出变量的关系，是最常用的多变量回归方法。

在定性判别模型中，利用准确率、精确率、召回率、F1得分来对模型进行评价[14]，这些指标越接近1，模型分类结果越好；在定量回归模型中，采用校正集相关系数(Rc)、校正集均方根误差(RMSEC)、预测集相关系数(Rp)、预测集均方根误差(RMSEP)对结果进行评价，其中，相关系数越接近1，模型预测性能越好，均方根误差越接近0，模型越稳定[15]。

本研究中数据预处理、降维、绘图与建模均在Matlab2016a和Origin2017软件中完成。

2 结果与讨论

2.1 一元纯净物质的太赫兹光谱分析

各一元纯净物质的太赫兹时域谱如图2(a)所示，可以看出，聚乙烯和参考信号的幅值基本相同，说明聚乙烯对太赫兹波无吸收，但在时间上较参考信号呈现延迟；鱼粉、培氟沙星、氟罗沙星的太赫兹时域信号不仅在时间上较参考信号发生延迟，能量也发生了严重的衰减；四种物质的幅值由大到小依次是聚乙烯、氟罗沙星、鱼粉、培氟沙星，表明它们对太赫兹的吸收依次减小。各纯净物质频域谱如图2(b)所示，选取0.2～1.5 THz的有效数据进行后续分析。可以看出，各样品的幅值由大到小依次是聚乙烯、氟罗沙星、鱼粉、培氟沙星，说明对太赫兹的吸收依次减小，这与时域数据的分析结果一致。各纯净物质吸收系数曲线如图2(c)所示，可以发现聚乙烯的吸收系数趋向于零，与已有报道一致[6]；培氟沙星在0.775和0.988 THz处有明显吸收峰，其中0.775 THz处的吸收峰更强；氟罗沙星在0.919和1.088 THz有明显吸收峰，其中1.088 THz处的吸收峰更强；鱼粉对太赫兹没有吸收峰，但随着频率增大，其吸收系数增大。

图2 纯净物质的太赫兹光谱信息

2.2 二元混合物定性定量分析

2.2.1 混合物的吸收系数谱分析

为进一步研究二元混合物的吸收特性，分别将培氟沙星-鱼粉、氟罗沙星-鱼粉混合物中每个浓度的光谱数据求平均值，并利用SG对数据进行平滑。图3(a)和(b)分别为培氟沙星-鱼粉和氟罗沙星-鱼粉的吸收系数曲线，由图可知，两种抗生素与鱼粉混合后吸收峰仍然存在，培氟沙星-鱼粉的吸收系数曲线峰值在0.775和0.988 THz附近，氟罗沙星-鱼粉的吸收系数曲线峰值在0.919和1.088 THz附近；当频率大于1.3 THz时，两种混合物的光谱信号不稳定，信噪比较低；当浓度为3%和5%时，抗生素含量太少峰值被湮没，无明显吸收峰；整体上随着浓度的减少，吸收峰的幅值发生规律的衰减，说明适合进一步开展定性定量研究。

图3 二元混合物吸收系数谱

2.2.2 SPA特征频率选择

为进行定性定量建模研究，首先利用SPA算法对高维数据进行降维。在定性分类中，将两种混合物的吸收系数作为输入，类别标签作为输出，选取特征频率；定量分析中，将每一种类的吸收系数作为输入，浓度作为输出，选取特征频率。定性分类中，选取的特征频率为0.206，0.775，1.069和1.50 THz。定量分析中，培氟沙星-鱼粉选出的特征频率为0.775，1.275和1.144 THz，氟罗沙星-鱼粉选出的特征频率为1.069，0.988，1.231，1.269和1.50 THz。

2.2.3 定性判别建模结果分析

利用特征频率处的光谱数据建立SVM和BPNN分类判别模型。每个样本3次测量的数据都进行建模，一共306个数据，按照2∶1随机划分为校正集和预测集，每类样本中校正集为102个不同浓度的混合物，预测集为51个不同浓度的混合物。图4(a)和(b)分别为SVM和BPNN模型预测集判别结果，可以看出，在SVM模型中，有3个培氟沙星-鱼粉被误分为氟罗沙星-鱼粉，氟罗沙星-鱼粉全部判别正确。而在BPNN模型中，每种混合物都有两个被误分。表2为两种模型的评价指标，其中精确率和召回率是两种物质的平均值。由表2可得，SPA-SVM的准确率为97.06%，精确率为97.22%，召回率为97.06%，F1得分为97.06%。SPA-BPNN的准确率、精确率、召回率、F1得分均为96.08%。显然，SVM模型的判别结果更好，同时也说明SVM对于小样本的分类具有优势。

图4 定性判别结果

表2 定性判别结果评价指标

2.2.4 定量回归建模结果分析

建立全谱-PLSR，SPA-BPNN，SPA-MLR定量回归模型，校正集与预测集比为2∶1，每类样本中校正集个数为34，预测集个数为17，校正集和预测集随机进行划分。在PLSR模型中，主因子数设置为2。BPNN模型中，学习率设置为0.1，进行200次迭代训练。表3为二元混合物定量检测结果，可以看出，SPA-BPNN模型对培氟沙星-鱼粉预测结果最好，Rc，RMSEC，Rp和RMSEP分别为0.994 9，0.001 6，0.984 9和0.009 5。SPA-MLR模型对氟罗沙星-鱼粉预测结果最好，Rc，RMSEC，Rp和RMSEP分别为0.990 1，0.034 9，0.982 7和0.040 6。图5(a,b)分别为最佳预测模型的实际浓度与预测浓度的散点图，由图可知，校正集和预测集的浓度均匀分散在直线y=x的两侧，说明预测效果较好。

表3 二元混合物定量检测结果

图5 最佳预测模型测量与预测浓度散点图

3 结 论

应用THz-TDS技术对鱼粉基质中培氟沙星、氟罗沙星这两类典型喹诺酮类抗生素进行定性定量分析研究。实验采集了培氟沙星、氟罗沙星、聚乙烯、鱼粉纯净物质以及培氟沙星-鱼粉、氟罗沙星-鱼粉17种不同浓度混合物的太赫兹光谱数据。首先对所有压片样品太赫兹光谱特性进行研究分析，结果发现，培氟沙星对太赫兹的吸收峰为0.775和0.988 THz，氟罗沙星对太赫兹的吸收峰为0.919和1.088 THz，聚乙烯对太赫兹的吸收接近于零，鱼粉对太赫兹无吸收峰，两种抗生素与鱼粉混合后吸收峰仍然存在。接着对鱼粉中的抗生素进行了定性定量分析，数据选取范围为0.2～1.5 THz，建模之前利用SPA进行降维选取特征频率。在建立的SVM和BPNN分类判别模型中，SVM模型判别结果更好，预测集判别准确率、精确率、召回率、F1得分分别为97.06%，97.22%，97.06%和97.06%；在建立的全谱-PLSR，SPA-BPNN和SPA-MLR定量回归模型中，几种建模方法的预测结果都较好，预测集相关系数均在0.95以上，其中，培氟沙星-鱼粉的最佳预测模型为SPA-BPNN，Rp为0.984 9，RMSEP为0.009 5，氟罗沙星-鱼粉的最佳预测模型为SPA-MLR，Rp为0.982 7，RMSEP为0.040 6。研究表明利用THz-TDS技术结合化学计量学方法对喹诺酮类抗生素培氟沙星和氟罗沙星进行定性定量检测是可行的，为利用太赫兹技术实际检测饲料中的这两种抗生素提供理论和技术参考。