卜一凡，张 涛，2，陈静静，2，江 波*，2

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡214122；2.江南大学 食品安全国际联合实验室，江苏无锡214122）

D-阿洛酮糖分子式为C6H12O6，是一种稀有糖。由于具有较低的热量但却有蔗糖70%的甜度，它为糖尿病人和肥胖人群提供了传统糖制品的替代品，因此，D-阿洛酮糖备受关注[1]。D-阿洛酮糖在自然界中少量地存在于甘蔗、小麦等植物中[2-3]；化学合成法制备D-阿洛酮糖由于较多的副产物、复杂的纯化步骤而受到限制[4]；而通过D-阿洛酮糖3-差向异 构 酶 （D-psicose 3-epimerase，EC 5.1.3.30，DPEase）催化D-果糖生产D-阿洛酮糖有许多优势，例如简单的纯化过程和较高的产物浓度等[5]。枯草芽孢杆菌是一种食品级微生物，非致病性，且拥有高效分泌蛋白质的能力[6]，常用在抗生素、酶制剂的制备中。本研究所用的Bacillus subtilis1A751/pUB-P43dpe-dal[1]为作者所在实验室前期构建的具有双启动子、无抗生素抗性的基因重组枯草芽孢杆菌，在前期实验中，其在Super-Rich培养基中的最高发酵酶活为6 U/mL。

该研究目的是利用此基因重组菌Bacillus subtilis1A751/pUB-P43dpe-da在3 L发酵罐水平上进行产DPEase的发酵优化，获得最适培养条件后进行补料培养来提高酶蛋白质表达量，以期为工业化制备D-阿洛酮糖提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.2 培养基

1）固体平板培养基（组分g/L） NaCl 10.0、蛋白胨10.0、酵母膏5.0，琼脂粉20.0；调节pH 7.0。

2）种子液体培养基（组分g/L） NaCl 10.0、蛋白胨10.0、酵母膏5.0；调节pH 7.0。

3）发酵培养基（组分g/L） 葡萄糖15.0、酵母膏20.0、蛋白胨10.0、NaCl 8.0、MgSO4·7H2O 1.0、Na2HPO4·12H2O 1.0。

1.1.3 主要试剂及仪器 葡萄糖、MgSO4·7H2O、NaCl、琼脂粉、Na2HPO4·12H2O、氨水、盐酸：购自国药集团；果糖：购自上海生工生物工程有限公司；酵母膏、蛋白胨：购自北京奥博星生物技术有限责任公司；其他试剂均为国产分析纯。

Waters e2695高效液相色谱：美国Waters公司产品；DASGIP四联3 L发酵罐：德国Eppendorf公司产品；MiniSpin离心机：德国Eppendorf公司产品；DK-8D电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；A360紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司产品。

1.2 培养方法

1.2.1 菌种活化与发酵罐培养 接种环蘸取甘油管保藏的菌种，平板固体培养基划线，37℃培养12 h。挑取单菌落转接入液体培养基中（装液体积分数10%），37℃、200 r/min培养12~14 h。将种子液按体积分数3%转接入已含发酵培养基的3 L发酵罐中。将搅拌速率、通气量关联溶氧值，以搅拌速率1 000 r/min、通气量2 vvm调节溶氧值为100%。发酵过程中定时取样测定OD600、酶活、葡萄糖质量浓度。

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1.2.2 发酵指标测定

1）菌体生长量的测定 调节分光光度计波长为600 nm，将所得的发酵液样品稀释至适宜的浓度，置于比色皿中读数，记录吸光值。

2）DPEase酶活的测定 取发酵液样品1 mL，12 000 r/min离心5 min，沉淀用磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 7.5）反复洗吹、离心3次，将菌体沉淀稀释至合适的浓度后，加到终体积1 mL用磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 7.5）配制的果糖底物溶液中（果糖质量浓度90 g/L，Mn2+浓度为1 mmol/L），55℃保温反应10 min，煮沸灭酶5 min后于12 000 r/min离心5 min，上清液过0.22μm滤膜，制样，HPLC分析。酶活定义：在55℃、pH 7.5条件下，每分钟内催化合成1μmol的D-阿洛酮糖所需的酶量为一个酶活单位（U）。

3）葡萄糖质量浓度的测定 取发酵液样品1 mL，12 000 r/min离心5 min，上清液稀释至合适的浓度后过0.22μm滤膜，制样，HPLC分析。

1.2.3 溶解氧（DO）对发酵的影响 在发酵过程中，分别控制DO为20%、30%，在初始碳源质量浓度为15 g/L、pH自然、37℃的条件下进行发酵，定时取样测定OD600值、酶活及葡萄糖质量浓度。

1.2.4 pH对发酵的影响 在发酵过程中通过流加14%氨水和13%盐酸控制pH，分别控制pH在6.0、7.0及自然；通过流加体积分数14%氨水控制pH≥6.0，在初始碳源质量浓度为15 g/L、温度37℃、DO为30%条件下进行发酵，定时取样测定OD600、酶活及葡萄糖质量浓度。

1.2.5 温度对发酵的影响 分别控制温度28、37、42℃，在初始碳源质量浓度15 g/L、pH 6.0、DO为30%条件下进行发酵，定时取样测定OD600值、酶活及葡萄糖质量浓度。

1.2.6 初始碳源质量浓度对发酵的影响 设置发酵培养基中初始葡萄糖质量浓度分别为15、20、25 g/L，在温度37℃、pH 6.0、DO为30%条件下进行发酵，定时取样测定OD600值、酶活及葡萄糖质量浓度。

1.2.7 补料时机对发酵的影响 在温度37℃、初始碳源质量浓度15 g/L、pH 6.0、DO为30%条件下进行发酵，分别在第4、5、6、7小时进行补料，流量30 mL/h，补料瓶成分为540 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O，即碳源补料速率为16 g/（L·h），定时取样测定OD600值、酶活及葡萄糖质量浓度。

1.2.8 补料碳源速率对发酵的影响 在温度37℃、初始碳源质量浓度15 g/L、pH 6.0、DO为30%条件下进行发酵，第5小时进行补料，流量30 mL/h。补料瓶成分分别为135 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O、270 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O、400 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O、540 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O，即碳源补料速率分别为4、8、12、16 g/（L·h），定时取样测定OD600值、酶活及葡萄糖质量浓度。

2 结果与分析

2.1 DO对发酵的影响

有研究表明，DO值较低时影响菌体代谢，而过高的DO值虽然可以使菌体迅速生长，但是容易导致菌体衰老，产量下降[7-9]。枯草芽孢杆菌是好氧菌，控制发酵过程的中的DO值对于菌体发酵和产酶具有重要作用[10]。图1显示了DO值分别为20%、30%和DO自然时对发酵的影响。可以看出，未控制体系DO时，OD600值增长缓慢，菌体生长受限，同样也不利于产酶。而DO值为20%和30%的情况下，菌体得以生长并且产酶量增高。DO为30%时，酶活最高，因此选择DO为30%作为最适DO条件。

图1 DO对发酵的影响Fig.1 Effect of DO on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.2 pH对发酵的影响

pH可以影响菌体细胞膜的通透性和代谢，进而影响发酵进程[11-12]。分别控制发酵pH为6.0、7.0、pH自然和pH≥6.0，结果见图2。在pH 6.0和自然的条件下，菌体增长较为缓慢，但在pH 6.0条件下6 h达到最高酶活，为78.3 U/mL。在pH 7.0条件下，菌体量达到最大后骤降，可能是由于流加的盐酸、氨水量破坏了菌体。在维持pH≥6.0的条件下，碳源耗尽之后pH开始增加，发酵罐系统停止补充氨水，体系体积不再增长，使得测试的菌体量和酶活都出现了“二次增长”的现象。重组菌在4种pH控制条件下达到的最高酶活分别为78.3、62.3、46.3、42.4 U/mL，所以选择pH 6.0作为最优的发酵pH。

图2 pH对发酵的影响Fig.2 Effect of pH on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.3 温度对发酵的影响

分别设置28、37、42℃以研究温度对重组菌发酵过程的影响，结果见图3。随着温度的升高，菌体的生长、酶活的升高、葡萄糖消耗速度都随之加快。最高酶活出现在37℃的实验组，温度过高、过低都不适合菌体发酵，温度过高会导致重组蛋白质的折叠紊乱进而形成包涵体[13]，长时间的高温也会导致酶的失活。而较低的温度使得菌体生长、产酶速度过慢。因此，选择37℃为最佳的发酵温度。

图3 温度对发酵的影响Fig.3 Effect of temperature on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.4 初始碳源质量浓度对发酵的影响

碳源对菌体发酵和产酶具有重要作用，是需求量最大的营养要素[14]。在确定最佳DO、pH和温度后，分别设置发酵培养基中15、20、25 g/L的初始葡萄糖质量浓度。当初始葡萄糖质量浓度为15 g/L时，菌体生长和产酶较快，而质量浓度为25 g/L时，最高酶活仅为53.4 U/mL，但菌体增长情况与20 g/L的实验组相似，见图4。当培养基中碳源质量浓度过高时，菌体由于脱水而菌体量下降[15]，并且CcpA蛋白的产生会抑制酶蛋白的转录翻译，酶活下降[15-18]。综上，确定发酵培养基最适的初始葡萄糖质量浓度为15 g/L。

图4 初始碳源质量浓度对发酵的影响Fig.4 Effect of initial carbon source concentration on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.5 补料时机对发酵的影响

在确定初始培养条件后，对发酵体系进行补料，其中葡萄糖和MgSO4·7H2O补料速率分别为16、0.6 g/（L·h），基于此条件对补料起始时间（4、5、6、7 h）进行了优化。由图5可知，在发酵的第4、5、6、7小时分别对应发酵罐中葡萄糖的残余质量浓度为10、4、0、0 g/L。3种补料方式中，从7 h起开始补料的实验组结果较不明显，这是由于补料时间太迟，菌体发酵过程中不利产物的积累一定程度上影响了菌体对补料的吸收。

图5 补料时机对发酵的影响Fig.5 Effect of feeding time on cell growth，enzyme activity and glucose consumption during fermentation

当起始补料时间为4、6 h时，最高酶活仅为55.1、74.1 U/mL，低于未补料的酶活78.3 U/mL。而在第5小时开始补料，不仅在发酵过程中获得了最高的酶活，且在后期酶活能够维持在较高位，因此，较好的补料起始时间为第5小时。

2.6 补料碳源速率对发酵的影响

基于上述结果，较佳的补料时间为第5小时，分别设置葡萄糖补料速率4、8、12、16 g/（L·h），其中MgSO4·7H2O为0.6 g/（L·h）。如图6（a），补料之后的菌体量均上升，最高OD600值由17.8上升至36.8。如图6（b），补料组的酶活出现了“双峰”的趋势，这是由于补料的结果。当补料速率为12、16 g/（L·h）时，第6小时的酶活低于未补料的对照组，考虑到图6（a）中6 h菌体量显著高于对照组，说明此时酶活的降低可能并不是因为补料的稀释作用，而是因为此速率补料对补料后1 h内的酶活产生一定的抑制作用。这两种补料速率在中后期出现了葡萄糖的不断积累，导致酶活低于补料速率为4、8 g/（L·h）的实验组。而补料速率为4 g/（L·h）时，后期酶活也降至较低水平，结合图6（c）中其葡萄糖质量浓度变化，推测酶活降低的原因为4 g/（L·h）补料速率不能满足菌体对葡萄糖的需求，体系中葡萄糖耗尽未得到及时补充。当补料速率为8 g/（L·h）时，菌体在9 h达到最高酶活123.0 U/mL，并且酶活能够长时间保持高位，因此选择8 g/（L·h）的补料速率。

图6 碳源补料速率对发酵的影响Fig.6 Effect of feeding rate on cell growth，enzyme activity and glucose consumption during fermentation

3 结 语

在对DO、pH、温度、初始葡萄糖质量浓度进行优化后，确定了最适条件为：DO 30%，pH 6.0，温度37℃、初始葡萄糖质量浓度15 g/L。该发酵条件下酶活为78.3 U/mL。在此基础上进行补料培养，最适补料条件为：在发酵第5小时分别以8 g/（L·h）和0.6 g/（L·h）的速率流加葡萄糖与MgSO4·7H2O，在发酵第9小时达最高酶活，为123.0 U/mL，是优化前产酶能力的24倍。CHEN等[19]、FU等[20]通过枯草芽孢杆菌在7.5 L发酵罐中补料生产DPEase，获得酶活分别为95 U/mL（84 h）、74 U/mL（72 h），发酵周期较长导致耗时和成本增加。而该研究中的发酵方法为工业化生产D-阿洛酮糖奠定了基础，后续可对分段控制pH和DO值等进一步优化。