韦登秀，张成华，黄云霄，胡安龙

(1.贵州大学 农学院，贵阳 550025；2.贵州大学 作物保护研究所，贵阳 550025； 3.山东省农业科学院，济南 250100；4.毕节市植保植检站，毕节 551700)

小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]属鳞翅目菜蛾科，是一种世界性迁飞害虫，分布广泛，已经成为全球为害十字花科植物的毁灭性害虫[1]。据统计，小菜蛾危害蔬菜所造成的损失一般为30%～50%，严重时可达90%以上，甚至绝收[2]。防治小菜蛾的方法有很多种，但化学防治效果较好[3]。然而，对于大多数农药，特别是杀虫剂，只有＜0.1%的施药量到达并作用于靶标[4]。氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)是目前农业生产中防治小菜蛾的常用药剂之一。据调查[5]，氯虫苯甲酰胺的大量、不科学使用，导致小菜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等害虫抗药性日趋严重。相关研究表明，2011 年以来，小菜蛾对新型双酰胺类药剂氯虫苯甲酰胺的抗药性全面爆发，广东地区抗药性最高可达1 749.96 倍[6]。时隔一年，Wang 等[7]监测到42 000 倍抗药性的抗氯虫苯甲酰胺小菜蛾田间种群。此外，农药过度施用还会造成对环境的污染及农产品质量安全等。因此，寻找绿色农药新剂型以降低农药的残留危害和提升利用率，成为当前农药剂型发展的热点方向[8]。近10 年以纳米材料为载体的纳米农药制剂逐渐成为了人们的研究课题。

通过机械破碎，用纳米加工手段将农药活性成分直接加工成纳米级粒子；利用纳米载体通过吸附、偶联和包裹等方式装载农药，是人们获得纳米农药新剂型的2 种方式[9-10]。关于纳米农药制剂的研究与应用，国内已有一些报道[11]，但是针对新型杀虫剂氯虫苯甲酰胺的纳米制剂研究尚未涉及。

基于此，本研究利用普鲁兰酶解法进行脱支处理[12]，切开支链淀粉分支点中的α-1,6 糖苷键，后用过量的无水乙醇进行沉淀，制成直链淀粉纳米颗粒并包埋农药，制备出10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂，并采用浸虫法测定了97%原药、35%水分散粒剂、10%纳米可湿性粉剂对小菜蛾的室内毒力，旨在为纳米淀粉囊材包裹农药的研发生产及其在小菜蛾化学防控中的应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器：JSM-7200F 型扫描电子显微镜(SEM) (北京捷欧路科贸有限公司)；GZX-9140MBE 型恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；Protect-1FD/117122004 型超净工作台(瑞士梅特勒公司)；XS105DU 型分析天平(瑞士梅特勒公司)；SF818 型离心机(张家港市高宏离心机制造有限公司)；VELP AMI4 型磁力搅拌器(常州维度仪器制造有限公司)；HWS 28 型恒温水浴锅(上海达平仪器有限公司)；LGJ-10C/E 型冷冻干燥机(四环福瑞科仪科技发展有限公司)；培养皿(Φ60 mm，上海五一玻璃仪器厂)、养虫笼等。

药品和试剂：蜡质玉米淀粉(众诚食化生物科技)；普鲁兰酶液(宁夏夏威实业集团有限公司)；磷酸缓冲液(诺伦生物有限公司)；99%甲醇(济南润丰宝利来工贸有限公司)；97%氯虫苯甲酰胺原药(南京红太阳股份有限公司)；35%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂(山东邹平农药有限公司)；10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂(贵州大学农安实验室)。

1.2 供试昆虫

供试昆虫为小菜蛾。虫卵购自河南济源科云生物有限公司，将买回的小菜蛾虫卵放入恒温培养箱进行孵化，将孵化的1 龄幼虫移至装有滤纸的培养皿中进行人工饲料饲养。供试人工饲料是购自河南省济源白云实业有限公司。

人工饲料饲养法[13]：准备好培养皿、滤纸，将滤纸放入消好毒的培养皿里，把饲料切成正方形小块后放入培养皿中，最后将刚刚孵化的幼虫移至培养皿中。1～2 龄时饲料可以适量少些，3～4 龄后饲料需要加量，1～2 龄时2 天更换1 次培养皿，3 龄以上时每天更换1 次。观察小菜蛾虫龄达老熟幼虫后移至干净的培养皿待其化蛹，完全化蛹后可移至养虫笼待其羽化。取生长基本一致的2～3 龄幼虫供生测试验用。

1.3 试验方法

1.3.1 纳米农药的制备

1.3.1.1 直链淀粉纳米颗粒的制备

称取10 g 淀粉于250 mL 烧杯中，加入100 mL磷酸缓冲液(pH=5.0)，搅拌均匀。于100 ℃水浴加热成糊状，将糊化好的淀粉冷却至60 ℃，加入23 mL (1 mL 酶液+66 mL 无菌水)普鲁兰酶液，搅拌均匀，放入60 ℃水浴锅中水浴6 h，随后置于电炉上加热煮沸8 min 使酶失活，将煮沸后的淀粉液加入50 mL的离心管中，3 000 rpm 离心15 min，除去未脱支的分子，取上清液加入烧杯中，后分两种方式加入无水乙醇：⑴ 无水乙醇体积是淀粉液的3 倍；⑵ 无水乙醇体积是淀粉液的10 倍；然后，放入4 ℃的冰箱里静置过夜，第2 天取出上清液，留下沉淀，将沉淀冷冻干燥24 h 后取出，放入研钵里研细，再装入密封袋中并放入4 ℃冰箱冷藏备用[14]。后用扫描电镜(SEM)对其进行表征，将制备成功的纳米颗粒用于制备10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂。

1.3.1.2 10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂的制备

称取制备好的蜡质玉米淀粉纳米颗粒1 g 于250 mL 锥形瓶中，加入20 mL 去离子水溶解，超声洗涤器超声1 h，并放入121 ℃高压灭菌锅中灭菌30 min，取出后置于90 ℃水浴锅中水浴平衡2 h，使其进一步溶解。称取97%氯虫苯甲酰胺原药0.5 g于烧杯中，加200 mL 酒精溶解完全，随后将药液逐滴加入水浴2 h 后的蜡质玉米淀粉溶液中，磁力搅拌器搅拌6 h，4 ℃冰箱静置过夜，取出静置好的药液除去上清液，然后分别采用2 种方法进行改造。第1 种是冷冻干燥法，将沉淀预冻过夜，次日将预冻好的材料放置于冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，取出充分研磨后装入密封袋，放入4 ℃冰箱冷藏待用。第2 种是烘干法，直接将静置好的药液倒入培养皿中，于70 ℃温度下烘干6 h，刮下药粉，充分研磨后装入密封袋，放入4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3.2 10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂的表征

称取1 mg 的样品溶入10 mL 蒸馏水中，超声5 min 使其分散均匀后，用滤膜过滤后备用；将过滤液滴于带有碳支持膜的铜网上，用液氮速冻后再将铜网冷冻干燥，将干燥后的样品放入扫描电子显微镜(SEM)系统中，抽真空5 min，在20 kV 加速电压下观察，统计并记录样品粒径大小。

1.3.3 10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂质量指标测定

10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂技术指标：⑴ 水分测定：采用卡尔费休水分测定仪进行测定。⑵ 热贮稳定性测定：参照GB/T19136—2003 农药热贮稳定性测定方法进行，热贮试验为2 周，温度为(54±2) ℃。⑶ pH 测定：酸度用微机型精密pH计法进行测定。⑷ 悬浮率测定：参照GB/T14825—2006《农药悬浮率测定方法》进行测定。⑸ 湿润性测定：按GB/T5451—2001《农药可湿性粉剂湿润性测定方法》进行测定。

1.3.4 室内毒力测定

室内毒力采用浸虫法测定[15]。根据参照预试验结果，每种农药设置5个浓度梯度：0、1、2、4、8、16 mg/L。每个浓度处理供试虫源15 头，设置重复3次，以清水作为对照处理。将生长状况一致的2～3龄幼虫放置于干净的培养皿中，将试虫放入塑料网罩中，于如上浓度药液中浸渍5 s 后取出，放在滤纸上爬行，待其自行晾干后，移至铺有滤纸并置有饲料的洁净培养皿中，用保鲜膜封口，用牙签在保鲜膜上扎小孔。最后将培养皿置于温度(27±1) ℃，湿度为75%～85%，光照为L∶D=14 h∶10 h 的智能人工气候箱内，在24 h 和48 h 后分别观察和记录试虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。判断试虫死亡标准为，用毛笔轻触虫体，不动者视为死亡。

1.4 数据处理

根据试验记录数据，以对照死亡率低于5%视为有效测定，算各处理的死亡率和校正死亡率。计算公式如下：

所有试验数据用 Microsoft Excel 2019 进行处理，将校正死亡率转换为机率值后，采用DPS 数据处理系统进行分析，求出每种药剂的毒力回归方程、LC50及95%置信限。

2 结果与分析

2.1 直链淀粉纳米颗粒表征及直径

由图1 可知，在SEM 500 nm、1 µm 2 个视野中观察到，不同处理下的直链淀粉纳米颗粒大小不一；由表1 可知，当无水乙醇与淀粉液的体积比为3∶1时，粒径分布范围广，粒径为10～8 000 nm，平均粒径为186.70 nm；当无水乙醇与淀粉液的体积比为10∶1时，并延长超声时间为20 min，粒径范围在10～76 nm，平均粒径为52.23 nm，说明制备纳米颗粒以无水乙醇和淀粉液的体积比为10∶1 时为最合适。

图1 直链淀粉纳米颗粒扫描电镜(SEM)图

表1 直链淀粉纳米颗粒粒径测定结果

2.2 10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂表征及直径

由图2 可知，在SEM 500 nm、1 µm 2 个视野中观察到，10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂的外貌形态不规则，大多近似球状。粒径大小较为均一，粒径大小为40～85 nm，平均粒径为64.22 nm。

图2 10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂SEM 图

2.3 10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂的质量指标

质量指标检测结果见表2。可见，制备的制剂外观为淡黄色，其有效成分含量为10.12%，水分含量为0.92%，粒径为64.22 nm，pH 为6.8，热贮稳定性为合格状态，悬浮率为98.7%，湿润时间为2.6 min。

表2 10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂的质量指标检测

2.4 氯虫苯甲酰胺对小菜蛾的毒力

氯虫苯甲酰胺对小菜蛾室内毒力测定结果见表3。可见，在设定的5 种浓度下，氯虫苯甲酰胺97%原药、35%水分散粒剂、10%纳米可湿性粉剂处理后24 h，平均校正死亡率分别是13.64%～81.82%、13.33%～ 77.88%和11.63～83.72%；药后48 h 时，分别为16.28%～ 97.62%、18.60%～95.35%和19.05%～97.62%，说明10%纳米可湿性粉剂药后24 h 对小菜蛾的平均校正死亡率是最高的；药后48 h，除16 mg/L 浓度外，35%水分散粒剂对小菜蛾的平均校正死亡率略高于10%纳米制剂和97%原药，但均未达到显著差异(p＞0.05，p＞0.01)。

表3 氯虫苯甲酰胺对小菜蛾的致死率

将表3 中氯虫苯甲酰胺浓度与小菜蛾死亡机率值之间进行线性回归，结果见表4。可见，10%纳米可湿性粉剂药后24 h 对小菜蛾室内毒力优于97%原药和市售的35%水分散粒剂。处理后24 h 和48 h 时，3 种氯虫苯甲酰胺药剂对小菜蛾的毒性从大到小的顺序分别为10%纳米可湿性粉剂＞35%水分散粒剂＞97%原药和35%水分散粒剂＞10%纳米可湿性粉剂＞97%原药。

表4 10%氯虫苯甲酰胺纳米可湿性粉剂对小菜蛾的毒力测定结果

3 结论与讨论

本研究结果表明，药后24 h，氯虫苯甲酰胺10%纳米可湿性粉剂对小菜蛾的活性优于97%原药和35%水分散粒剂。Feng[16]等研究发现利用纳米微胶囊包裹的氯虫苯甲酰胺纳米农药较水分散粒剂具有较强的释放率，提高了农药的有效利用效率和生物利用度。此外，Gao[17]等制备了一种智能纳米载体，用于传递氯虫苯甲酰胺，对小菜蛾的可持续防治起到一定增强作用。可见，应用纳米技术制备微胶囊、载体用于包裹或传递农药，均有利于提高杀虫活性，为害虫的高效治理提供了一种有前景的策略。