王燕春，崔贞亮（编译）

（宁波三生生物科技股份有限公司，浙江 宁波 315000）

试验目的：定时输精技术是利用外源性生殖激素调控母猪的性周期和排卵的一种技术，它能够提高母猪养殖利用率、减少非生产天数、提高养猪场管理效率。本研究的试验目的优化这个技术的程序。

试验结果：孕激素饲喂42 h后，eCG-15D组母猪在人工授精前的卵泡直径大于其他组。eCG-15D组中的排卵时间同步，该组母猪全部在定时人工授精的第25天的第2次人工授精前排卵。此外，eCG-15D组母猪的妊娠率、分娩率、出生仔猪总数和活仔数最高。该项研究的结果表明，在常规定时人工授精前15 d用马绒毛膜促性腺激素预处理母猪可以优化生殖性能。

1 介绍

定时输精（Fixed-time artifi cial insemination，FTAI）是一种无需发情识别即可辅助繁殖的有效技术，它使用外源性生殖激素来调控母猪的性周期，包括发情和排卵的时间。因此，该技术可以帮助解决养猪业规模化发展带来的母猪隐性发情率高、养殖利用率低的问题。

使用FTAI时，后备母猪的窝产仔数明显不同。例如，对饲喂烯丙孕素（Altrenogest，ALT）后备母猪繁殖性能的分析表明，窝产仔数和活产仔数显著改善。同样，用烯丙孕素ALT和促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）类似物处理后，猪的发情率和仔猪初生体重显著增加，但是产仔数没有变化。另一项最新研究发现，停止ALT处理后，肌肉注射马绒毛膜促性腺激素（Equine chorionic gonadotropin，eCG）和猪促黄体生成素可缩短产仔时间，但会降低窝产仔数。在实践中，FTAI的生育率结果存在相当大的差异。试验小组之前的一项研究发现，当两种母猪接受相同的FTAI方案处理时，处在发情期的母猪表现出更强烈的发情反应和更高的妊娠率。因此，母猪的卵巢状况可能会极大地影响FTAI的效率。

eCG通过促进卵泡发育、促进排卵和卵巢黄体化发挥双重功能，类似于促卵泡激素（Folliclestimulating hormone，FSH）和促黄体激素（Luteinizing hormone，LH）。根据之前试验中使用的eCG处理浓度（800～1 000 IU)，发现用eCG处理母猪可以有效促进卵泡发育，在注射eCG后第5天排卵。 因此，在FTAI之前用eCG对后备母猪进行预处理，以诱导激素控制母猪的发情周期，从而提高繁殖性能。值得注意的是，在开始FTAI前15 d和20 d注射eCG，根据母猪的发情周期时间分别同步使后备母猪进入卵泡期和黄体期。

在该研究中，旨在通过在孕激素饲喂前15 d或20 d给后备母猪注射1 000 IU马绒毛膜促性腺激素来优化传统的定时人工授精程序。进行常规定时人工授精后，监测和分析卵泡发育、排卵和生殖激素水平，为优化后备母猪定时人工授精程序提供基础。

2 试验设计

2.1 动物和管理

该项试验使用190日龄、90 kg体重的健康大白×长白二元杂交母猪（n=166），这些母猪的生殖状况未知。试验期间，将母猪随机分为不同的组，并在相似的环境下放置到不同的栏位进行繁殖。母猪可以自由饮水，并获得由相同批次的玉米、豆粕、菜籽粕和麦麸制备的相同饲料（表1）。在eCG-15D、eCG-20D和对照组中，采用6头（12月龄～36月龄）已证实有生育能力的公猪精液。使用计算机辅助精液分析仪——CASA系统测定这些精子的活力和浓度。只选择精子活力超过70%，正常形态大于90%或更好的精液。评估测定结束后，立即将每1份精液在37℃的商品稀释液中充分稀释，最终按照体积每80 mL含有3×109个精子细胞的剂量储存。在人工授精（AI）后的第25天，用超声波检查母猪是否怀孕。如果无法确定怀孕情况，则在第1次检查后10 d对母猪进行重新检查。

表1 试验猪日粮的组成、化学成分和营养价值（以干物质为基础）

2.2 试验程序

试验设计和程序如图 1 所示。后备母猪随机分为三组：对照组（CON，n = 62）、eCG-15D 组（n = 50）和 eCG-20D 组（n = 54）。Altrenogest、eCG、GnRH均购自中国浙江宁波三生生物科技，除ALT外其他采用肌肉注射。 eCG-15D 组（n = 50）猪在FTAI前15 d注射1 000 IU eCG，而eCG-20D组（n = 54）猪 在FTAI前20 d注 射1 000 IU eCG。简而言之，猪口服烯丙孕素ALT（每头猪每天20 mg），持续18 d，然后在停止烯丙孕素ALT饲喂后42 h，给母猪注射由1 000 IU组成的eCG，然后100μg GnRH 80 h后。后备母猪在注射GnRH 24 h后第1次授精，16 h后再次授精。24 h后对有站立反应的后备母猪再进行授精。在FTAI的第20天（停止ALT后42 h）收集血样，并在第1～3天和第20～26天使用超声监测卵泡发育。

图1 定时输精程序

2.3 卵泡发育和排卵检测

在第1天至第3天和第20天至第26天，使用5 MHz凸面换能器（HS-1600，日本丰桥本田电子有限公司）对每组16头母猪每天进行两次经腹超声检查（上午08：00和下午14：30），以检测每头母猪卵巢中的卵泡发育。当大小为6～9 mm卵泡消失时，界定为发生排卵。直径大于12 mm且连续几天可见的卵泡被定义为囊性卵泡。从随后的分析中排除了来自具有多个囊性卵泡的母猪的数据。

2.4 采血和激素分析

在停止ALT喂养后42 h进行采血。处理后备母猪后，使用10 mL 注射器从颈前静脉采集血样，并转移到5 mL凝血管中30 min。血液凝固后，样品以1 000 g离心4 min，将血清分离到离心管中并储存在-20℃的冰箱 中。LH （JM-10117P1）、黄体酮（P4，JM-01368P1）和雌二醇（E2，JM-01314P1）使用酶联免疫吸附法进行分析，检测范围分别为22-800 pmol/L、8-200 pmol/L和20-500 pg/mL。使用购自日本Cosmo Bio的商业试剂盒直接分析FSH（CSB-E06791P），检测范围为20-700 IU/mL。

2.5 数据

所有母猪的发情检测都是通过观察红肿的外阴和有无站立的反射来进行的。发情检查每天进行2次（上午08：00和下午16：00）。与成熟公猪进行鼻对鼻接触和背压试验，以检测母猪的发情，表现出站立反应即被认为是发情。当排卵前6～9 mm大小的卵泡消失时，排卵被认为已经发生。在分娩日，母猪自然生产。

2.6 数据分析

首先测试卵泡发育数据的正常性，然后使用SAS的混合程序进行分析。LSMEANS声明中包括通过Turkey方法调整的PDIFF选项，以说明处理之间的多重比较。处理之间的差异在P＜0.05时显著差异。使用卡方检验分析比较了后备母猪的排卵时间分布及其发情、排卵和妊娠率，P＜0.05时显著差异。

3 结果

3.1 固定时间人工授精期间替代后备母猪的卵泡发育和激素水平

第1天的超声分析显示eCG-15D组的卵巢中有黄体，但在eCG-20D组中没有（图2C 和2D），而在CON组中观察到黄体和卵泡（图2A和2B)。此外，还测量了整个FTAI的卵泡直径，发现第1天eCG-15D、eCG-20D和CON组的平均卵泡直径分别为2.63 ± 0.15 mm、3.20 ± 0.15 mm和3.45 ± 0.15 mm，图2E）。这些结果表明，每组后备母猪的卵巢在FTAI开始时处于不同的阶段。在烯丙孕素ALT饲喂18 d内卵泡生长受到抑制，但eCG-15D组的卵泡直径增加（2.90 ± 0.15 mm）至高于eCG-20D的水平（2.60 ± 0.15 mm，P＜ 0.05），对照组CON（2.50 ± 0.15 mm，P＜0.05)在停止ALT喂养后42 h（第20天）。第20天下午处理后，3组卵泡均开始发育，体积明显增大。值得注意的是，在D24-PM（第1次人工授精）时，eCG-15D（6.10 ± 0.15 mm）组的平均卵泡直径显著高于其他2组（eCG-20D：5.80 ± 0.15 mm；CON：5.46 ± 0.15 mm；图2B）。

图2 各组后备母猪卵泡发育趋势

3.2 母猪人工授精前激素变化与排卵时间

评估ALT饲喂停止后42 h激素水平的变化以及后备母猪在被AI处理之前的排卵。有趣的是，eCG-15D、eCG-20D和CON组 的后备母猪中E2、LH和P4没有差异（P＞ 0.05，图3A、3B、3C）。然而，eCG15D组的FSH水平低于CON组（P＜ 0.05，图3D）。此外，eCG-15D组后备母猪的排卵时间集中在1 d内，而eCG-20D和CON组的排卵时间分别分布在2 d和4 d（图3E）。3组都是在第25天早上的排卵率最高，分别为87.5%（eCG-15D组）、56.25%（eCG-20D组）和43.75%（CON组）（图3E）。

图3 各组后备母猪激素水平变化

3.3 定时输精对后备母猪繁殖性能的影响

分析了FTAI对繁殖性能的影响，如表2所示。尽管eCG-15D组的发情（96%）、妊娠（92%）和分娩率（90%）略高于其他组，但差异无统计学意义。然而，eCG-15D组的所有小母猪在第1次授精后24 h内排卵，高于eCG-20D组或CON组（CON组和eCG-20D组为81.25%，P＜ 0.05）。此外，在eCG15D组中出生的仔猪总数和活仔数明显高于eCG-20D组或CON组（表2）。

表2 不同处理组的后备母猪的繁殖性能

4 讨论

FTAI是一种有效的辅助繁殖技术，通过使用外源生殖激素来调控母猪的性周期，以解决与养猪业大规模发展相关的隐性发情率高和配种利用率低的问题。然而，母猪的卵巢状况会极大地影响FTAI的效率。以往用eCG治疗母猪可以刺激卵泡生长和排卵，有效促进卵泡发育，提高繁殖性能。因此，在该项研究中，旨在通过在烯丙孕素ALT喂养前15或20 d给后备母猪注射eCG来优化传统FTAI程序。

尽管有报道称，在用eCG处理母猪后，存活数和窝产仔数没有显著增加，但注射eCG 可以促进卵泡发育提高繁殖性能，并已广泛应用于养殖业。以前的研究表明，725～1 000 IU eCG 可以将后备母猪的发情率提高到70%～100%，而363～600 IU eCG只能达到25%～52%。因此，在本研究中选择了1 000 IU eCG 进行预处理。在早期的研究中，试验数据显示，在注射eCG 5 d后FTAI可达到最大水平。同时，E2、LH和FSH在第5天急剧增加，eCG组处理后5～6 d排卵。因此，eCG在后备母猪中诱导了发情周期，并使卵泡发育和排卵时间同步。根据母猪的繁殖周期，假设后备母猪的卵巢在排卵后第10天处于黄体期，在排卵后第15天处于卵泡期。因此，在预处理后15 d和20 d进行了FTAI操作，以探讨不同卵巢状态对后备母猪FTAI功效的影响。

当FTAI定时输精程序开始（第1天）时，eCG-15D组的卵泡平均大小＜3 mm，这表明在eCG注射1～15 d后，卵泡将出现在黄体期。eCG-20D组和CON组的母猪卵泡大小与eCG-15D组相似，这表明eCG-20D组和CON组的母猪卵巢中出现了正在发育的卵泡。结合超声波分析结果，得出结论，eCG-20D组的母猪处于卵泡期，而CON组的母猪同时处于黄体和卵泡期。ALT饲喂18 d后，3组的卵泡都同步到相同的水平，其直径小于3 mm，这表明ALT有效地阻止了中小型卵泡的发育，以控制同步发情。与预期相同，eCG-15D组在eCG注射后（第20天）卵泡直径最大，与Soede的结果一致。由于eCG具有促卵泡活性，而GnRH可以有效改善LH分泌，促进优势卵泡的最终成熟和排卵，因此在eCG注射后（第20天），卵泡直径往往会随时间增加。肌肉注射GnRH后，3组母猪的卵泡直径增加至观察到的最大水平，然后在人工授精后第2天（第26天）再次降至3 mm以下，表明排卵已经结束。

后备母猪受孕主要取决于排卵和受精的时间。理论上，精子在受精后24 h表现出最佳生育能力；因此，早期或晚期受精都可能会对母猪的生育能力产生负面影响，从而导致怀孕次数减少、受精率降低，并降低胚胎存活率。由于人工授精在第24、25天的下午和上午进行，最佳排卵时间应该在第25天。研究发现eCG-15D组的排卵率在第25天最高（94.5%），在24 h内完成排卵，表明排卵更加集中和同步。然而，研究还发现eCG-20D组和CON组的18.9%和6%小母猪分别在25 d后排卵（图3E），因此错过了受精的最佳时间。卵泡发育和排卵时间差异的原因与后备母猪的激素分泌密切相关。因此，在停止烯丙孕素ALT喂养后42 h收集了血液样本，以测量激素水平的变化。尽管FSH水平在eCG-15D组中最低，但它们也具有最高的均匀性（图3D）。这可能是由于以下事实: FSH在eCG-15D组的后备母猪中不仅被外源性ATL补充抑制，在黄体期分泌的内源性孕酮也被抑制。此外，通过eCG和GnRH治疗进一步改善了小母猪的卵泡发育和排卵。

eCG-15D组的繁殖性能显著改善，包括排卵率、产仔数和活产仔数。同样，该组的发情和怀孕率会更高；这些变化在统计学上并不显著，这可能是因为母猪数量较少。eCG-15D组母猪的超声波监测进一步显示，它们的卵泡发育和排卵时间优于其他组，因为它们在FTAI开始时处于黄体期。此外，eCG15D组的所有母猪都在第2次输精前完成排卵，这可能解释了与其他组相比，eCG15D组的妊娠率和产仔数更高。综上结果表明，FTAI前15 d注射eCG可以改善母猪的繁殖性能和强化管理。

原文题目：《Equine chorionic gonadotropin pretreatment 15 days before fixed-time artificial insemination improves the reproductive performance of replacement gilts》

原文作者：Q Zhao，C Tao， J Pan， Q Wei，Z Zhu， L Wang， M Liu，J Huang ， F Yu，X Chen，L Zhang， J Li

原文出处：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34844186/PMID: 34844186DOI: 10.1016/j.animal.2021.100406