闲少玲

（肇庆市食品检验所，广东肇庆 526000）

四环素类抗生素是一种由放线菌产生的广谱性抗生素，有良好的杀菌抑菌作用[1]。一些养殖场为追求利益，作为饲料添加剂给禽畜进食，降低禽畜发病率，改善产品质量，长期大量不合理使用四环素类药物，会导致动物源性产品体内残留，从而危害人体健康。因此需严格监控动物源性食品中四环素类药物残留量以维护人体健康。目前，四环素类抗生素残留量的检测方法有紫外分光光度法[2]、高效液相色谱法[3-5]、液质联用法[6-7]等多种方法。本次研究采用通过高效液相色谱法对鸭肉中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素残留量进行检测，并对该方法进行了优化、分析检测效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土霉素、四环素、金霉素和强力霉素标准品；HLB固相萃取柱；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，试验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

安捷伦1260高效液相色谱仪，二极管阵列检测器；全自动浓缩仪；电子天平；pH计；高速台式冷冻离心机；全自动智能氮吹仪；多管漩涡混合器。

1.3 实验方法

精密称取粉碎混合5.0 g鸭肉样品，置于50 mL离心管中，加入20 mL的Mcllvaine缓冲液，涡旋振荡5 min，低于15 ℃条件下10 000 r/min转速，离心5 min，移出上清液，在剩余残渣中分别加入15 mL的Mcllvaine缓冲液重复提取两次，合并3次上清液，并定容至50 mL，混匀。将提取液用快速滤纸过滤，收集过滤液，准确吸取10 mL滤液，滤液经HLB固相萃取柱净化，用3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，35 ℃氮吹近干，用流动相溶解并定容至1 mL，0.45 μm滤膜过滤，滤液供上机测定。

1.3.1 溶液配制

（1）标准储备液。称取土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准品各10.0 mg，分别用甲醇溶解并定容100 mL，各抗生素浓度为100 μg/mL，于-18 ℃条件下存储。

（2）混合标准溶液。用流动相将标准储备液根据需要配制成适当浓度混合标准液。

（3）Mcllvaine缓冲液。称取柠檬酸12.9 g、磷酸氢二钠27.6 g、乙二胺四乙酸二钠37.2 g，用水溶解后稀释并定容至1 000 mL。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Shim-pack GIST C18；流动相：A为草酸水溶液（0.01 mol/L），B为乙腈︰甲醇（1︰1）；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：365 nm；进样量：50 μL。流动相梯度洗脱见表1。

表1 流动相梯度洗脱

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

以4种抗生素的峰面积和分离度为指标，选用 Aielent5 TC C18、BIossmate psv C18、Shim-pack Veloxsp C18和Shim-pack GIST C18等不同色谱柱对鸭肉中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的分离效果，见图1。结果表明，在1.3.2的色谱条件下Shim-pack GIST C18色谱柱，4种抗生素达到较好的分离效果，适合分析各目标物，且各目标物峰形良好。

图1 样品加标分离色谱图

2.2 流动相的选择

采用Shim-pack GIST C18作为分析色谱柱，分别选用甲醇∶乙腈（1∶1）-0.01 mol/L三氟乙酸，乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钠，乙腈∶甲醇（1∶1）-0.01 mol/L草酸水溶液等流动相作土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的分离度及色谱响应效果的选择。结果表明，采用甲醇∶乙腈（1∶1）-0.01 mol/L三氟乙酸，土霉素、四环素两者完全不能分离。采用乙腈-0.01 mmol/L磷酸二氢钠，土霉素、四环素两者未彻底分离，峰形较扁平，出峰时间滞后。当采用乙腈∶甲醇（1∶1）-0.01 mol/L草酸水溶液，土霉素、四环素两者能完全分离，峰形尖锐。因此选择乙腈∶甲醇（1∶1）-0.01 mol/L草酸水溶液作为流动相，4种抗生素响应值较好，且经过梯度洗脱后具有更好的分离效果和灵敏度，再改变流动相比例缩短出峰时间。

2.3 提取溶剂的选择

本实验采用5%的高氯酸和Mcllvaine缓冲液作为样品中4种抗生素提取溶剂，通过空白鸭肉加标回收实验进行提取效果比较，采用Mcllvaine缓冲溶液时效果最好，回收率均高于5%高氯酸提取溶剂回收率。说明Mcllvaine缓冲溶液提取能力较强，因此选择Mcllvaine缓冲液作为样品提取溶剂最为合适，再结合与HLB固相萃取柱净化，有效去除其杂质，回收率、重现性不易被影响。不同pH值提取溶剂对4种抗生素分离度均有一定影响，考虑到四环素类抗生素一般情况在弱酸条件下比较稳定，将Mcllvaine缓冲溶液设为pH值为3.5，可有效分离，且不会影响峰形。

2.4 检测波长的选择

通过二极管阵列检测器进行测定，选检测波长在350～365 nm对加标样品进行检测，随着检测波长增大，峰面积逐渐增大，在365 nm时吸收最大，干扰小，灵敏度高，因此选择365 nm检测波长为最佳吸收波长。

2.5 标准曲线与检出限

在1.3.2的色谱条件下，绘制4种抗生素标准曲线，以3倍信噪比，准确计算检出限。结果如表2所示。在实验浓度范围内，4种抗生素浓度、峰面积具备良好线性关系。

表2 线性参数与检出限

2.6 加标回收率和精密度

实验采用空白鸭肉样品中分别加入4种抗生素混合标准溶液，使样品溶液最终浓度为0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、1.0 μg/mL，每个水平重复测定 6次，计算平均回收率和精密度，结果见表3。土霉素加标回收率为85.7%～89.3%，4环素回收率为83.2%～84.8%，金霉素回收率为92.4%～97.5%，强力霉素回收率为87.0%～90.7%，4种抗生素RSD为0.9%～3.0%，说明本实验方法准确度高、精密度好。

表3 加标回收率和精密度（n=6）

3 结论

通过此次实验研究，优化高效液相色谱法色谱条件，改进测定方法，可以更好地分离土霉素、四环素、金霉素和强力霉素，且使用本方法前处理简单，灵敏度高，分离效果好，准确度高，可以满足四环素类抗生素检测要求，值得推广应用。