聚两性电解质作冷冻保护剂的应用及进展

2022-05-28牛文雅占太杰胥义

制冷技术 2022年1期

牛文雅，占太杰，胥义

（上海理工大学生物系统热科学研究所，上海 200093）

0 引言

生物样本库的建设是推动精准医疗发展的重要基石之一[1-4]，而低温保存被认为是高质量保存生物样本的重要措施[5-8]。特别是低温生物医学领域自20世纪70年代以来，诸多研究团队深入研究了生物样本降温冷冻、贮藏、复温以及临床使用过程中存在的关键问题，如冻融过程中冰的形成和生长导致的机械性损伤以及细胞内/外溶质浓度的改变导致的渗透性损伤等[9-10]。在生物样本低温保存过程中添加低温保护剂（Cryoprotective Agent，CPA），可以减少相关损伤，显著提高样本存活率，使生物样本实现高质量的长期保存[11-12]。

根据穿透细胞膜的能力，常用CPA可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性保护剂多为小分子中性物质，如二甲基亚砜（DMSO）[13-15]、乙二醇[16]和甘油等，但这些可快速透过细胞膜的保护剂有一定的基因毒性，会造成细胞的DNA等遗传物质受到损伤。因此大多需要解冻后立即将其去除[17]；非渗透性保护剂多为小分子糖类或大分子物质，如蔗糖[18-20]、羟乙基淀粉（HES）[21-22]、聚乙烯咯烷酮（PVP）[23-25]和抗冻蛋白（AFPs）[26-27]等，但这类保护剂不能透过细胞膜，可在胞外发挥作用，抑制冰晶生长，诱导胞内脱水，使得胞内浓度提高，实现胞内玻璃化，一般与渗透性保护剂共同使用，可以减轻单一类型CPA对细胞的伤害、显著提高细胞复温后的存活率[28]。

近年来，围绕着低毒性、高效率CPA的开发已成为生物样本保存的热点问题之一[29]。2009年，MATSUMURA等[30]首次报道了一种聚两性电解质羧化聚赖氨酸（COOH-PLL），该物质有较低的细胞毒性和较高的冷冻保存效率，且与各种类型的细胞相容性较好，已经成功实现了红细胞[31]、人肺癌细胞（A549）[32]、小鼠胚胎[33]等样本的冷冻保存，展现出了较大的应用前景。但对于聚两性电解质作为冷冻保护剂的相关作用机制尚在探索中。

本文将介绍聚两性电解质现有的分类合成方法，阐述其在冷冻保存过程中潜在的低温保护机制，并讨论其作为一种新型CPA在低温保存中的应用研究进展。

1 聚两性电解质分类及合成方法

聚两性电解质也称两性聚电解质[34]，是由带正电和负电的单体亚基组成的聚合物体系。它们既可以是电中性的，也可以是带有正或负电荷的[35]。这些带电基团之间的分子间和分子内离子相互作用会影响聚两性电解质的结构和性质[36]。依据它们在水溶液中对pH变化的响应强弱（弱基团对pH变化的响应更大），聚两性电解质存在4个亚类[37]（图1）。已知的天然两性电解质包括蛋白质和多肽[38]，电荷沿着其组成的一级结构以序列定义的模式分布。但对于人工合成的聚两性电解质，电荷可以以无序或统计方式分布[39]。现阶段聚两性电解质一般由聚两性电解质单体组成。而通过两性离子单体的聚合、引入疏水/亲水基团或者聚合后的修饰[40]等多种方法即可制备不同的聚两性电解质单体（图2），如：逐步生长聚合（Step-growth）[41-42]、自由基聚合（Free Radical Polymerization，FRP）[43]、可逆失活自由基聚合（Reversible Deactivation Radical Polymerization，RDRP）[44-45]和开环易位聚合（Ring-Opening Metathesis Polymerization，ROMP）[46]等。随着对各种合成方法的深入研究，可以聚合得到更多结构不同的聚两性电解质，大大拓展了其在纳米医学[47]、材料科学[48]、催化[49]和海洋应用[50]等方面的推广和使用。

图1 聚两性电解质的4个亚类的代表性结构

图2 应用各种合成技术聚合成的聚两性电解质单体

2 聚两性电解质的冷冻保护机制探索

聚两性电解质作为一种低毒性的新型CPA，已经成功用于小鼠成纤维细胞L929[51]、不同类型干细胞[52]、血液中红细胞[53-54]等样本的低温保存。而深入探究其在低温保存过程中的冷冻保护机制，将有助其推广应用于细胞工程和组织工程等领域。现阶段，聚两性电解质作为CPA的保护机制主要包括冰重结晶抑制活性、与细胞膜的相互作用、在细胞周围形成缓冲区域3种不同的假说。

2.1 冰重结晶抑制活性假说

细胞冷冻保存后复温的过程中，冰晶的再生长会导致膜破裂和脱水，从而导致细胞死亡[55]。有研究表明可以利用冰重结晶抑制剂来控制该过程。如自然界广泛存在的、具有较高热滞活性、能改变冰晶生长特性和抑制冰晶重结晶的蛋白质，即抗冻（糖）蛋白（AF(G)Ps）[56-57]。受AF(G)Ps启发[58]，MITCHELL等[59]在2014年首次对聚两性电解质的冰重结晶抑制（IRI）活性进行定量研究。通过对聚甲基丙烯酸氨基乙酯后聚合改性、然后与琥珀酸酐反应生成聚两性电解质，结果显示出较强的IRI活性，可以很大程度上降低细胞等样本在复温过程中冰重结晶风险。为了直观了解聚两性电解质的IRI活性，STUBB等[60]对比了聚两性电解质与PBS缓冲剂在显微镜下的冰晶尺寸。结果显示聚两性电解质的平均晶粒尺寸更小，显示出在抑制冰晶生长方面有较好的作用。尽管如此，聚两性电解质的IRI活性仍小于AF(G)Ps，说明冰重结晶活性可能并不是聚两性电解质冷冻保护机制的主要原因，但利用AF(G)Ps的结构进行新型聚两性电解质的合成，可能提高其冰重结晶抑制活性，从而实现更高效率的样本保存。

2.2 与细胞膜的相互作用假说

尽管IRI活性是决定整个冻存体系防冻能力的重要参数之一，但在保存生物样本时，聚两性电解质如何与生物样本相互作用可能更加关键。有研究发现，当细胞在聚两性电解质溶液中冷冻时，聚两性电解质分子会附着在细胞膜上[62]，维持膜结构的稳定性，并且这种作用随着聚合物浓度的增加以及疏水性基团的引入而增强[63]，如图3所示。

图3 聚两性电解质与细胞膜相互作用[63]

CROWE等[64]发现海藻糖或蔗糖等物质可以稳定细胞膜结构，降低其从凝胶态到液晶态的相变温度。RAJAN等[63]研究了聚两性电解质与细胞的相互作用，利用差示扫描量热仪（Differential Scanning Calorimeter，DSC）获得聚两性电解质存在时脂质的热谱图，发现聚两性电解质同样也可以降低了磷脂膜的双层凝胶-液晶的转变温度，并且随着聚两性电解质浓度的增加，转变温度下降的越明显。为了进一步证明其与膜的相互作用方式，采用电子自旋共振（Electron Spin-resonance Spectroscopy，ESR）光谱，通过探针对膜磷脂双分子层进行旋转标记，研究聚两性电解质对膜极性区域的影响，发现具有明显冷冻保护特性的聚两性电解质会与膜的外表面相互作用，这种相互作用可以保护膜免受各种冷冻诱导的破坏。据此，这种与细胞膜的强烈相互作用被诸多研究者看作聚两性电解质冷冻保护机制一个重要组成部分。

2.3 细胞周围形成缓冲区域假说

除了冰重结晶抑制活性、膜保护机制外，还有一种观点认为：聚两性电解质在细胞周围形成富含聚合物的液相，在细胞周围提供无冰的局部环境，并促进细胞脱水以抑制细胞内的冰晶[65]。解冻过程中，聚合物的液相区域融化速度快，细胞被浓缩的聚合物溶液包围覆盖，从而在细胞和剩余的冰之间形成了一个缓冲区，这个缓冲区可以减小重结晶带来的细胞损伤（图4）。因此，这种作用机制可能赋予了聚两性电解质高效的冷冻保存效率。

图4 细胞周围形成缓冲区域[65]

3 聚两性电解质冷冻保护剂的应用

聚两性电解质具有补充或替代DMSO和其他冷冻保护剂（例如非渗透性CPA）的潜力。前期关于聚两性电解质在冷冻保存方面的工作都集中于琥珀酸酐改性的羧化聚赖氨酸[30]（COOH-PLL），因其优良的低温保存特性，逐渐吸引了更多的研究人员开发了一系列的聚两性电解质用作CPA，将它们单独使用或与其他CPA结合使用时都能提高样本的存活效率，如表1所示。

表1 其它聚两性电解质作为冷冻保护剂

3.1 聚两性电解质在冷冻保存中的应用

3.1.1 第一种用作保护剂的聚两性电解质

2009年，MATSUMURA等[30]首次发现在保存L929细胞时，通过合成COOH-PLL（制备路线如图5所示）用作CPA可以实现良好的保存效果，且表现出比DMSO更高的冷冻保存效率和更低的细胞毒性。进一步研究发现，COOH-PLL的保护效果与其正负基团比例相关（如表2），当其正负基团拥有适量比例且羧基略多时IRI活性最高，冷冻保存效果最好，这说明聚两性电解质的结构对保护效果至关重要。另有文献[62]证明COOH-PLL不会影响细胞的表型特征和后续增殖能力，细胞在-80 ℃冰箱冻存24个月，解冻后仍能保持其良好的存活和增殖能力。对于部分哺乳动物细胞的冷冻保存，如牛卵丘细胞[66]、人真皮成纤维细胞等[67]，选用COOH-PLL作为单一型CPA可实现其低温保存。

图5 羧化聚赖氨酸（COOH-PLL）制备路线[30]

表2 使用不同羧基/氨基比例的COOH-PLL保存，解冻后的L929细胞活力

而对于猪胚胎、胰岛等大型样本的低温保存，COOH-PLL单一型CPA效果并不理想。若此时将COOH-PLL与其他CPA（乙二醇、甘油和葡聚糖等）结合使用，保存效率则会有明显的提升。表3所示为COOH-PLL单一使用或与其他CPA结合使用时保存各类细胞的研究进展。

表3 COOH-PLL作为冷冻保护剂

1.3.2 其余物质为前体的聚两性电解质

COOH-PLL展现了出色的保护效果，但制备COOH-PLL所需的前体聚赖氨酸较为昂贵。于是MITCHELL等[54]利用一种低成本的共聚物，即马来酸酐作为前体，通过自由基聚合反应生成1∶1正负电荷比的聚两性电解质。并且证明这种聚两性电解质显示出特定的IRI活性，与羟乙基淀粉共同使用时可以显著提高冷冻保存后红细胞的存活率。通过自由基聚合反应合成的聚两性电解质高效且成本低廉，但无法控制聚合物的分子量及其分散性。BALLEY等[53]同样基于马来酸酐共聚物为前体开发了一种的新型区域规则性的聚合物，这种聚两性电解质与DMSO相比，不仅可以使解冻后的A549细胞存活率达89%以上，而且还可以使更弱的细胞系，如小鼠脑神经母细胞瘤细胞（Neuro-2a）和小鼠颅骨成骨细胞（MC-3T3）存活率提高三倍。另外，ZHAO等[65]合成以丙烯酰胺基为前体合成的三元聚两性电解质（PDA30与PDA45），材料同样易得、且水解稳定，合成步骤简单。但这种新型的保护剂显示出分子结构和分子量的依赖性，仅当分子量为49 kDa的PDA30表现出与10%DMSO相近的低温保护效果。然而，仅使用丙烯酰胺基为前体的聚两性电解质作为CPA保存后的细胞，经过24 h后存活率会略微降低。但若是将2%的DMSO加入到10%丙烯酰胺基为前体的聚两性电解质中，可显著改善细胞存活率。

RAJAN等[61]利用可逆加成-断裂链转移聚合（RAFT）的方式，以甲基丙烯酸（MAA）和甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯（DMAEMA）为前体合成了一种聚两性电解质。这种新型的聚两性电解质可以将冻融后L929细胞的存活率提高到90%以上。与此同时，少量疏水性基团的引入可以显著提高它们的低温保护性能。其中可能的原因是疏水度的增加导致冰晶尺寸减小[64]。但引入疏水性基团增加低温保存效率不是通用的。ZHAO等[65]将疏水性基团结合到聚两性电解质中，期望进一步提高细胞存活率。但是发现随着疏水性基团浓度增加细胞存活率反而下降。可能的原因是聚两性电解质在较高的疏水含量下，聚合物链的溶剂化减弱导致结构塌陷。其中大部分疏水基团都在塌缩的螺旋内，无法发挥作用。从而导致对冰晶的抑制作用较弱。因此疏水性基团的引入如何改善聚两性电解质的冷冻保护活性仍需要进一步研究。

通过不同前体物质的探索，应用到不同生物样本中，聚两性电解质作为CPA表现出良好的低温保存效果，尽管部分聚两性电解质暂时不能完全代替DMSO作为冷冻保护剂，但是通过与其他类型的CPA联合使用，有望实现传统含DMSO型保护剂替代使用。

3.2 聚两性电解质CPA的新型使用方法

传统聚两性电解质作为CPA使用时，通过直接溶解在水溶液中制得CPA溶液体系，再加载到生物样本中进行低温保存，但是通过化学合成方法，利用聚两性电解质内部带电荷的官能团之间的离子交联形成的聚两性电解质水凝胶，表现出良好的生物相容性[72]与多功能性，且在控制药物释放、调控降解过程以及定标靶向位置等方面显示出较大的应用价值[73]。

聚两性电解质水凝胶也可作为低温保存载体，用于细胞生物样品的低温保存。2013年，JAIN等[74]利用点击化学法开发出一种基于葡聚糖的聚两性离子水凝胶（图6），用于在冷冻保存之前封装细胞形成构建体。这种基于葡聚糖的聚两性电解质水凝胶可将L929细胞存活率提高到90%，并且无需同时加载其他CPA。但这种水凝胶只对悬浮细胞显现出良好的保护效果，在保存单层细胞或者厚度较大的样品时效果不佳。除了利用点击化学法制备的聚两性电解质水凝胶，JAIN等[75]利用聚两性电解质与锂皂石之间相互作用，将解冻后载有聚两性电解质的细胞与适量的皂石混合形成智能水凝胶，用于特定部位的细胞递送和组织修复。细胞在这种水凝胶系统中冻融后仍能存活，使用时无需洗脱CPA。因此有希望使其成为长期储存系统和合适的现成组织工程产品。