任斌，杨雷方，丁新民，梁继芳

创伤性颅脑损伤是世界范围内重要的健康问题[1]。据估计全世界每年约有548万的颅脑损伤患者，其中约20%为重型颅脑损伤，发病特点为病情危重且进展快、预后差，病死率高达30%～50%[2-3]。手术是治疗该类患者的重要方法，术后患者病情的准确判断及预后评估也至关重要。因此寻找与创伤性颅脑损伤病情演变相关的检验指标具有重要的临床意义。

可溶性α-Klotho蛋白是一种跨膜可裂解蛋白，在人体内广泛表达，其为一种体液因子，可发挥多种生物学作用[4]。动物模型研究证实Klotho蛋白缺乏可引起机体提前老化，过度表达则有助于长寿与认知功能改善[5]。近年来，其在中枢神经系统疾病中的作用逐渐被关注和研究。本研究通过检测103例重型颅脑损伤且行手术治疗患者血清可溶性α-Klotho蛋白水平随时间的变化规律，分析其与患者病情演变及预后评估的关系，探索重型颅脑损伤患者预后评估相关的生物学标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年7月至2020年9月山西白求恩医院重症医学科收治的重型颅脑损伤行手术治疗需术后监护的患者103例作为病例组，其中男86例、女17例；年龄20～57岁，平均年龄（48.3±9.7）岁。另选取同期在本院体检的健康志愿者50例作为对照组，其中男34例、女16例；年龄24～58岁，平均年龄（44.6±8.1）岁。纳入标准：（1）经颅脑CT、磁共振成像（MRI）等检查符合《中国重型颅脑创伤早期康复管理专家共识（2017）》[6]中的重型颅脑损伤诊断标准，格拉斯哥昏迷量表（GCS）评分3～8分；（2）伤后24 h内入院并行急诊手术治疗，且住院时间≥7 d；（3）年龄≥18周岁且临床资料完善、签署知情同意书。排除标准：（1）既往明确诊断有脑梗死、脑出血及短暂性脑缺血发作等病史；（2）合并高血压、糖尿病等慢性疾病；（3）合并恶性肿瘤；（4）未能完成临床诊疗，中途自动出院或入院后7 d内死亡。根据病例组患者生存结局将其分为生存亚组（n=74）与死亡亚组（n=29）。本研究通过山西白求恩医院伦理委员会审核批准（YXLL-2019-024）。

1.2 方法

1.2.1 血清可溶性α-Klotho蛋白水平的检测 分别于病例组患者入重症医学科第1、3、5、7天采集静脉血3 ml，对照组入组第1天采集静脉血3 ml，以3 500 r/min离心10 min，离心半径0.5 cm，留取上清液，置于-80℃冰箱中保存备测。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清可溶性α-Klotho蛋白水平，试剂盒采用武汉博士德生物工程有限公司的KLOTHO ELISA试剂盒（货号：EK1688）。

1.2.2 临床资料收集 利用SPSS 22.0软件建立数据库，由双人完成临床资料数据录入，包括：姓名、住院号、性别、年龄、体质指数（BMI）、治疗方式、入院时急性生理和慢性健康状况评估Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHE Ⅱ）评分、GCS评分及血细胞分析、血生化等临床检测指标。所有临床检测指标由本院检验科统一检测。

1.2.2.1 APACHE Ⅱ评分 APACHE Ⅱ评分由KNAUS等[7]于1985年提出，包括年龄、急性生理学评分（APS）、慢性健康状态评分（CPS）3部分，其中APS包括血气分析、血常规、生命体征等各项指标；CPS包括肝脏、肾脏、心血管、呼吸及免疫抑制等方面，量表总分为各部分评分之和，总分为0～71分。

1.2.2.2 GCS评分 GCS包括睁眼反应、语言反应和肢体运动3个方面，共计15分[8]。

1.2.2.3 血细胞分析及血生化指标检测 所有研究对象于入院即刻抽取静脉血6 ml，取3 ml置入EDTA抗凝管充分摇匀保存，采用全自动血细胞分析仪（美国贝克曼，型号：DXH800）检测白细胞计数、中性粒细胞计数、血小板计数；另取3 ml置入分离胶/促凝管，以3 500 r/min离心10 min，采用全自动生化分析仪（贝克曼，型号：5821）检测血红蛋白、白蛋白、血糖、尿素氮、肌酐。

1.2.3 生存结局定义 将住院28 d内因死亡或病情加重自动离院的患者定义其生存结局为死亡，将病情好转并转入普通病房或好转出院的患者定义为生存。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0及Medcalc 19.0软件进行统计分析及绘图，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用非参数检验；计数资料以相对数表示，两组间分析采用χ2检验；重复测量资料的比较采用重复测量方差分析。应用受试者工作特征（ROC）曲线评价不同时间点指标的预测价值，组间比较采用Delong法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生存亚组与死亡亚组患者基线资料比较 生存亚组和死亡亚组年龄、性别、BMI、休克发生率、GCS评分、血糖比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；生存亚组平均动脉压（MAP）、血小板计数、白蛋白、尿素氮、肌酐、APACHE Ⅱ评分低于死亡亚组，白细胞计数、中性粒细胞计数、血红蛋白高于死亡亚组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 生存亚组与死亡亚组患者基线资料比较Table 1 Baseline data of patients with severe craniocerebral injury

2.2 病例组和对照组不同时间点血清可溶性α-Klotho蛋白水平比较 病例组第1、3、5、7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。病例组不同时间血清可溶性α-Klotho蛋白水平比较，差异均有统计学意义（F=28.640，P<0.001）；其中第3、5天血清可溶性α-Klotho蛋白水平均高于第1天，第5、7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平均低于第3天，第7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平低于第5天，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 病例组和对照组不同时间点血清可溶性α-Klotho蛋白水平比较（±s，ng/L）Table 2 Comparison of the level of serum soluble α-Klotho protein between healthy controls and patients with severe craniocerebral injury at different time points

表2 病例组和对照组不同时间点血清可溶性α-Klotho蛋白水平比较（±s，ng/L）Table 2 Comparison of the level of serum soluble α-Klotho protein between healthy controls and patients with severe craniocerebral injury at different time points

注：对照组第3、5、7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平均采用第1天的数据；a表示与同组第1天相比P<0.05，b表示与同组第3天相比P<0.05，c表示与同组第5天相比P<0.05

组别 例数 第1天 第3天 第5天 第7天对照组 50 140.20±28.35 140.20±28.35 140.20±28.35 140.20±28.35病例组 103 173.67±3.08 204.90±5.25a 186.93±0.96ab 174.05±4.02bc t值 7.328 5.632 14.547 3.050 P值 <0.001 <0.001 <0.001 0.003

2.3 生存亚组与死亡亚组血清可溶性α-Klotho蛋白水平随时间的变化规律分析 组别与时间对血清可溶性α-Klotho蛋白水平存在交互作用（P=0.003），组间及时间对血清可溶性α-Klotho蛋白水平主效应显著（P<0.05）。其中第1、7天，生存亚组血清可溶性α-Klotho蛋白水平高于死亡亚组（P<0.05）；生存亚组第3天血清可溶性α-Klotho蛋白水平高于第1、5、7天；死亡亚组第3天血清可溶性α-Klotho蛋白水平高于第1、7天，第5天血清可溶性α-Klotho蛋白水平高于第1、7天，低于第3天，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 生存亚组与死亡亚组不同时间点血清可溶性α-Klotho蛋白水平比较（±s，ng/L）Table 3 Comparison of the level ofserum soluble α-Klotho protein betweensurvived and decreased patients with severe craniocerebral injuryat different time points

表3 生存亚组与死亡亚组不同时间点血清可溶性α-Klotho蛋白水平比较（±s，ng/L）Table 3 Comparison of the level ofserum soluble α-Klotho protein betweensurvived and decreased patients with severe craniocerebral injuryat different time points

注：a表示与生存亚组相比P<0.05；b表示与同组第1天相比P<0.05，c表示与同组第3天相比P<0.05，d表示与同组第5天相比P<0.05

组别 例数 第1天 第3天 第5天 第7天生存亚组 74 182.12±22.16 203.13±31.00b 188.19±10.25c 182.36±34.62a死亡亚组 29 167.48±24.53a206.86±33.86b 186.34±7.00bc 159.41±30.69acd F 值 F交互=4.912，F组间=6.127，F时间=18.387 P值 P交互=0.003，P组间=0.020，P时间<0.001

2.4 应用ROC曲线评价不同时间点血清可溶性α-Klotho蛋白水平对生存结局的预测价值 绘制重型颅脑损伤患者术后第1、7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平预测生存结局的ROC曲线，结果显示，ROC曲线下面积（AUC）分别为0.686〔95%CI（0.587，0.774）〕、0.710〔95%CI（0.612，0.796）〕，两者AUC比较，差异无统计学意义（Z=0.265，P=0.791），见图1。

图1 重型颅脑损伤患者术后第1、7天血清可溶性α-Klotho蛋白水平预测生存结局的ROC曲线Figure 1 ROC analysis of postoperative （days 1 and 7） serum soluble α-Klotho in predicting 28-day in-hospital survival in patients with severe craniocerebral injury

3 讨论

重型颅脑损伤是一种在我国临床常见的颅脑损伤疾病，其伤后颅内脑组织存在复杂的病理生理反应，其疾病的演变难以用临床神经功能检查及影像学检查来预测，且随着镇静治疗在神经重症监护病房的普及，神经功能检查有其局限性，其灵敏度差，而且时间滞后[9]。不同患者变化不同，快速变化如出现“talk and die”现象，缓慢者可数天后恶化[10]，因此，寻找与其疾病演变及预后判断相关的生化指标对于这类疾病的患者术后预后的准确判断具有重要意义[11]。

Klotho蛋白是Klotho基因编码的跨膜蛋白，研究证实Klotho蛋白通过分泌型和膜结合型两种类型对多个靶器官发挥生物学效应[12]，其中分泌型Klotho蛋白具有抗氧化、免疫调节、抗炎等多种作用，在多种疾病中具有保护作用[4]。急性缺血性脑卒中、阿尔茨海默病等疾病发病早期均可出现血清可溶性α-Klotho蛋白水平的明显升高，考虑可能与疾病早期的代偿性反应有关[13-14]。本研究发现颅脑损伤后患者也出现了Klotho蛋白水平的明显升高，与前述研究结果一致，且在伤后第3天达到峰值，这种变化规律与其生存结局无关，考虑其升高与颅脑损伤后患者缺氧、水肿、炎性反应等有关，在第3天达峰值，这与临床上颅脑损伤后脑水肿在创伤后3～4 d达高峰的时间相一致[15]，提示血清可溶性α-Klotho蛋白可作为颅脑损伤后患者颅内水肿进展的一个间接监测指标，有利于指导临床医师对该类患者的病情变化做出早期评估，指导临床决策制定。

重型颅脑损伤危害性较大，临床救治难度高，且预后影响因素存在较多变异性。重型颅脑损伤患者预后的早期评估是对治疗方案选择、资源的分配、患者的分类以及与患者家属沟通的重要因素[16]。因此该类患者的预后评估指标的筛选具有重要意义。本研究通过ROC曲线证实其术后第1天及第7天的血清可溶性α-Klotho蛋白水平均对预后具有预测价值，但二者间AUC比较无差异，考虑可能与本研究样本例数偏少有关，需进一步扩大样本量深入研究。

本研究存在一定局限性，首先，本研究为单中心研究，且样本例数有限，存在病例选择偏倚可能，可能会影响研究结果的价值，需进一步扩大样本量进行多中心前瞻性研究，从而为临床提供证据支持。其次，关于血清可溶性α-Klotho蛋白水平在颅脑损伤后变化的机制尚不十分明确，还需在动物实验中进一步深入研究其与颅脑损伤病情演变及预后关系的生物学机制。

综上所述，血清可溶性α-Klotho蛋白水平的监测可以实现对重型颅脑损伤患者病情演变及预后的判断，对于指导颅脑损伤患者临床治疗、优化治疗方案，具有重要的意义，且与预后具有相关性，可作为临床可行的一种监测手段进一步深入研究。

作者贡献：任斌进行文章的构思与设计、撰写论文，并提供研究经费支持；杨雷方进行研究的实施与可行性分析，进行数据分析与整理；丁新民进行统计结果的分析与解释及论文的修订；梁继芳进行论文思路的可行性评价，负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。