迟江 杜成兴,2 潘年琼 李松,2 杨迺嘉

（1.贵州省生物技术研究开发基地有限公司，贵州贵阳 550002；2.贵州省科晖制药有限公司，贵州清镇 551400）

炎可宁片[1]是由中药黄柏、大黄、黄芩、板蓝根和黄连5味中药组方，经加工制成的片剂，具有清热泻火、消炎止痢的作用。临床用于急性扁桃腺炎、细菌性肺炎、急性结膜炎、中耳炎、疖痈瘰疬、急性乳腺炎、肠炎、细菌性痢疾及急性尿道感染。炎可宁片在部颁标准中没有薄层鉴别和含量测定项，其制剂的质量无法有效地控制。我们前期进行了炎可宁片的质量标准[2-3]研究，制剂质量得到了控制。但在实际生产过程中发现黄柏浸膏的质量[4-7]直接影响了片剂的崩解时限。为了更好地控制炎可宁片的内在质量，我们对黄柏浸膏进行了薄层色谱鉴别，并采用高效液相色谱法对黄柏浸膏的盐酸小檗碱进行了含量测定，所建立的方法操作简便、分离效果好、专属性强、重复性也好，可有效地控制炎可宁片中黄柏浸膏的质量。

1.仪器和材料

1.1 仪器

AUW120D型电子天平（岛津仪器苏州有限公司），AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国赛默飞公司）；岛津手动高效液相色谱仪（日本岛津公司，包含SHIMADZU Essentia LC-16型输液泵、SHIMADZU SPD-16型紫外检测器、SHIMADZU Essentia CTO-16等），依利特C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。其他仪器均由贵州省生物技术研究开发基地有限公司提供。

1.2 材料

盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201212）购于中国食品药品检定研究院；盐酸黄柏碱（批号：Y-O87-121129）购于成都瑞芬思生物科技有限公司。黄柏浸膏样品、药材及试剂由贵州省生物技术研究开发基地有限公司提供。

2.方法和结果

2.1 色谱适应性条件

依利特C18柱（250mm×4.60mm，5μm）；流动相为乙腈：0.05ml/L磷酸二氢钾：三乙胺（35:65:0.1）；流速为1.0 ml·min-1；柱温30℃；检测波长为265nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 样品溶液制备方法

精密称取黄柏浸膏0.1g，加入25ml甲醇，超声10min，取出，称重，补足减少的重量，过滤，取续滤液2ml。用甲醇定容至10ml，过0.45μm微孔滤膜，作为样品溶液。

2.2.2 对照品制备方法

精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得。

2.3 线性关系考察

精密量取盐酸小檗碱对照品溶液，配制成6.28μg/ml，12.56μg/ml，25.12μg/ml，50.24μg/ml，100.48μg/ml，200.96μgml，401.92μg/ml溶液。分别进样10uL，以盐酸小檗碱浓度为X轴，峰面积为Y轴，得线性回归方程。结果表明，盐酸小檗碱在6.28μg/ml～401.92μg/ml范围内呈现良好线性关系，回归方程为Y=46558X+29207（r=0.9999）。

2.4 精密度实验

取盐酸小檗碱对照品溶液（50.24μg/ml）适量，按2.1项下色谱条件，进样6次，每次10μL，测定盐酸小檗碱的峰面积。结果显示RSD=0.18%，表明仪器精密度良好。

2.5 中间精密度实验

取盐酸小檗碱对照品溶液（50.24μg/ml）适量，按2.1项下色谱条件，进样6次，每次10μL，测定盐酸小檗碱的峰面积。结果显示RSD=0.94%，表明中间精密度良好。

2.6 稳定性实验

精密称取黄柏浸膏0.1g，按2.2.1项下制备方法，得样品溶液。按2.1项下色谱条件，间隔1h进样，进样6h共7次，每次10μL，计算样品中盐酸小檗碱的含量。结果显示RSD=0.53%，表明样品中盐酸小檗碱在6h内稳定。

2.7 重复性实验

精密称取0.1g黄柏浸膏6份，按2.2.1项下制备方法，得样品溶液，按2.1项下色谱条件进样，每次10μL，计算样品中盐酸小檗碱的含量。结果显示RSD=0.58%，表明实验重复性良好。

2.8 加样回收率实验

精密称取黄柏浸膏样品0.05g共9份，分为3组，编号。每组按样品取样量的50%、100%、150%分别加入盐酸小檗碱对照品，按2.2.1项下制备方法，得样品溶液。按2.1项下色谱条件，进样9次，每次10μL，计算样品中盐酸小檗碱的含量，见表1。结果显示，样品中盐酸小檗碱的平均加样回收率为99.65%，RSD=1.51%，表明实验可行性良好，该方法可用于黄柏浸膏的含量测定。

表1 加样回收率实验结果

2.9 含量测定

取10个不同批次的黄柏浸膏，每批称取2份，每份0.1g，按2.2.1项下制备方法，得样品溶液，按2.1项下色谱条件，进样10μL，计算样品中盐酸小檗碱的含量，结果见表2。结果显示：黄柏浸膏盐酸小檗碱的平均含量为43.32mg/g，最低含量为32.69mg/g。

表2 十批黄柏浸膏含测结果

2.10 薄层色谱鉴别

2.10.1 黄柏浸膏和药材薄层色谱鉴别

分别称取黄柏浸膏和黄柏药材细粉0.25g，加入25ml甲醇，超声30min，过滤，滤液挥干后，加1%醋酸水溶解后过滤，滤液挥干后，加少量甲醇，作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品和盐酸黄柏碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述4种溶液3uL～5uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷：甲醇：水（30:15:4）的下层溶液为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开、取出、晾干、喷以稀碘化铋钾试液显色。供试品色谱中，黄柏药材和黄柏浸膏在与盐酸小檗碱色谱相应的位置上显相同颜色的斑点如图1所示。

图1 薄层色谱图1

2.10.2 10批黄柏浸膏薄层色谱鉴别

分别称取10批黄柏浸膏样品0.25g，按2.10.1项下方法进行薄层色谱鉴定，如图2所示。结果表明：在供试品色谱中，10批黄柏浸膏样品在与盐酸小檗碱色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

图2 10批黄柏浸膏薄层色谱图

3.结语

在测定10批黄柏浸膏样品的含量时发现，黄柏浸膏中盐酸小檗碱的平均含量为43.32mg/g，最低含量为32.69mg/g，考虑到实际生产过程中含量会有所不同，因此我们暂将黄柏浸膏中的盐酸小檗碱的限量定为：每克黄柏浸膏含盐酸小檗碱不得少于30mg。经过方法学考察，黄柏浸膏中盐酸小檗碱在6.28μg/ml～401.92μg/ml范围内呈现良好线性关系，回归方程为Y=46558X+29207（r=0.9999），平均回收率为99.65%（RSD=1.51%），说明本方法专属性强，重现性好，可有效控制黄柏浸膏的质量，为炎可宁片的生产工艺控制提供了质量内控标准，也为炎可宁片的成品质量控制提供了保障。