郭严冬 张明霞 周义峰 戴锡玲 王全喜 曹建国*

（1. 江苏省中国科学院植物研究所，南京210014；2. 上海师范大学生命科学学院，上海200234）

近些年，结合其他技术对蕨类植物的研究有所增多。通过显微镜和切片技术可以观察到植物各器官的组织结构和发育过程，但细胞内一些细胞器以及糖类和脂类等生物大分子随发育发生的一些动态变化以及分布情况则需要结合组织化学染色等手段进行深入研究。早期，组织化学多用于医学药学方面的研究，如张作干对核蛋白分化染色的改变进行了观察；胡适宜等利用光镜结合组织化学染色对环氧树脂厚切片中多糖、蛋白质和脂类进行了鉴定。目前，利用组织化学方法鉴定细胞内的糖类、蛋白质和脂类等大分子物质已日益完善，成为了研究细胞内组织化学成分分布和动态变化的重要方法。将组织化学染色应用于蕨类植物卵发生过程的研究，可以定性和定位蕨类植物性器官发生过程中细胞器以及一些重要的大分子物质，为蕨类植物生殖生物学的深入研究奠定基础。

Bell等的研究结果显示：蕨（var.（Desv.）Underw. ex Heller）从配子体发育至卵细胞成熟经历了初生细胞阶段、中央细胞阶段、幼卵阶段和发育卵阶段4 个阶段。相关研究结果还显示一些原始种类如双扇蕨（（Kaulf.）Reinw.）等的卵在卵发生过程中始终含有丰富的淀粉粒，并且不产生核外突。Cao 等的研究结果显示：蕨类植物卵膜主要是由嗜锇性的囊泡和内质网片层堆叠于卵细胞质膜上表面形成的。这些研究表明不同类型蕨类植物卵细胞结构有所不同，且细胞器的发育也存在差异。

海金沙（（Thunb.）Sw.）演化地位特殊，且具有重要的药用价值和观赏价值。目前有关海金沙形态学和化学成分方面的研究已较为完善。而有关海金沙生殖生物学方面的报道并不多，对卵发生的细胞学研究内容也不够全面。并且，在海金沙卵发生过程中是如何产能与耗能的，一些主要的生物大分子在发育的各阶段的分布情况等诸多问题还有待深入的探索。鉴于此，本文以海金沙为材料，采用组织化学的方法对其卵发生过程中细胞中糖类和脂类的变化进行研究，以期为阐明海金沙有性生殖的机制及蕨类有性生殖的演化过程提供科学证据。

1 材料与方法

供试海金沙配子体包埋块由上海师范大学生命科学学院制备。使用PowerTome-XL 超薄切片和Hitachi-600 电镜对颈卵器的位置和发育阶段进行定位，卵发育每个阶段定位后切取切片3～6片（切片厚度70 nm）用于组织化学实验。采用Nikon E800光学显微镜观察并照相。

取1～3 片切片放于培养皿，加入水（自来水）浸泡1 min，后经质量体积分数1%的高碘酸氧化30 min，水冲洗1～2 次，加入锡夫试剂染色30 min，然后用水冲洗1 min，亚硫酸钠漂洗液漂洗3次、每次2 min，再次用水冲洗3 min，最后用蒸馏水经过；自然干燥后置于显微镜下观察卵发育各阶段的高碘酸-锡夫反应（PAS反应）情况。

将1～3 片切片置于体积分数70%乙醇中1～2 min，用体积分数0.3%苏丹黑B 液（体积分数70%乙醇新鲜配制）染色，置于40 ℃条件下染色30 min；之后用体积分数70%乙醇分色1 min，水冲洗，蒸馏水经过，自然干燥后置于显微镜下观察卵发育各阶段的苏丹黑B染色反应情况。

2 结果和分析

PAS 反应检测多糖类物质，染色呈红色，海金沙卵发生的PAS 反应结果（图版Ⅰ）显示：原始细胞时期，颈卵器细胞内出现红色淀粉粒（图版Ⅰ：1），但数量较少，周围营养细胞中红色淀粉粒数量较多。初生细胞时期，细胞内的淀粉粒数量变少（图版Ⅰ：2～3）。中央细胞至产生新卵，颈卵器细胞内的淀粉粒数量逐渐增加，卵细胞中淀粉粒体积较颈沟和腹沟细胞的大（图版Ⅰ：4～6）。卵发育时期，颈沟和腹沟细胞从边缘开始慢慢退化，退化形成的物质呈红色（图版Ⅰ：7～8），说明这些退化的絮状物质主要为多糖类物质。在卵细胞与腹沟细胞间形成分离腔和孔区时，卵细胞边缘也出现了一定程度的退化，但PAS 反应颜色较浅（图版Ⅰ：9～10），说明虽然卵细胞退化产生了一些多糖类物质，但没有颈沟和腹沟细胞多。颈沟和腹沟细胞随发育进一步退化，PAS 反应颜色较卵细胞周围的颜色深，此时卵细胞上表面的细胞质膜处未观察到有明显的颜色加深，即未有多糖类物质积累在细胞质膜处。卵内的淀粉粒已基本退化完全，壁细胞中仍有部分存在（图版Ⅰ：9～11）。卵成熟时期，颈沟和腹沟细胞退化完全，大量絮状物质充斥在细胞原有的位置，此时2个细胞间的界限还比较清晰，但卵细胞与周围壁细胞间出现空腔，空腔中含有多糖类物质，而卵细胞中不含有淀粉粒。卵细胞上孔区消失，此时卵细胞上方细胞膜处仍未有多糖类物质出现（图版Ⅰ：12～13）。随后退化的物质会从颈沟处排出颈卵器外，卵细胞变形严重，卵细胞内产生了一些PAS 反应为阳性的含多糖类物质的膜性结构，卵细胞上方形成空腔（图版Ⅰ：14）。

图版Ⅰ 海金沙卵发生的PAS反应1.原始细胞时期；2～3.初生细胞时期；4～5.中央细胞时期；6.幼卵时期；7～11.发育卵时期；12～14.成熟卵时期PlateⅠPAS reaction in the oogenesis of L.japonicum（Thunb.）Sw.1.Initial cell period；2−3.Primary cell period；4−5.Central cell period；6.Young egg period；7−11.Developmental egg period；12−14.Mature egg period

苏丹黑B 反应检测脂类物质，染色呈黑色，海金沙卵发生的苏丹黑B 反应结果（图版Ⅱ）显示：初生细胞至新卵时期，颈卵器内细胞基本无脂类的积累，壁细胞中出现了一些黑色的颗粒（图版Ⅱ：1～3）。颈沟和腹沟细胞逐渐退化形成黑色絮状物质，表明退化的物质中含有脂类物质，卵细胞内的物质苏丹黑B 染色呈阴性，说明此时卵细胞内基本不含有脂类物质（图版Ⅱ：4～5）。随孔区及分离腔的形成，颈沟和腹沟细胞基本退化完全，卵细胞中出现了一些黑色颗粒。壁细胞中黑色颗粒数量有所减少（图版Ⅱ：6～7）。成熟卵细胞变形严重，大部分细胞质和细胞器消失，体积减小，其中的黑色颗粒消失，卵细胞上方质膜并观察到有脂类物质的积累（图版Ⅱ：8～9）。

图版Ⅱ 海金沙卵发生的苏丹黑B反应1.初生细胞时期；2.中央细胞时期；3.幼卵时期；4～7.发育卵时期；8～9.成熟卵时期Plate Ⅱ Sudan black B reaction in the oogenesis of L.japonicum（Thunb.）Sw.1.Primary cell period；2.Central cell period；3.Young egg period；4−7.Developmental egg period；8−9.Matureegg perio d

总体上看，随着海金沙卵细胞发育直至形成新卵，质体中淀粉粒逐渐积累；但从新卵发育到成熟卵，质体中淀粉粒体积逐渐减小、消失，说明分离腔、孔区的产生以及细胞核的变形等都是一个耗能的过程。观察结果也显示一些脂类颗粒也出现在孔区及分离腔的形成后的卵细胞中。

3 讨论和结论

电镜观察结果显示：海金沙成熟卵细胞上的分离腔中均会有絮状物质出现，但随发育这些絮状物质会消失，形成空腔；且整个发育过程中均没有典型卵膜的出现（另文发表）。本研究结果表明：在海金沙卵细胞发生早期细胞均含有质体，内含淀粉粒，随发育卵细胞以及颈沟和腹沟细胞内淀粉粒数量和体积均有所减少，直至最后退化消失，其中，质体以及颈沟和腹沟细胞外产生的絮状物质的PAS 反应均呈红色，显示为多糖类物质。但苏丹黑B 研究表明：海金沙颈沟和腹沟细胞外产生的黏性物质也含有脂类物质，而卵细胞内并未有明显脂类物质产生。这从组织化学角度去验证了这些絮状物质的主要组成成分，也说明从卵细胞成熟至受精作用开始之前经历了较为复杂的能量产生与消耗过程。

问荆（Linn.）的组织化学研究结果表明：在问荆颈卵器发育早期，卵细胞以及腹沟和颈沟细胞中均含有淀粉粒；卵发育中期至后期，沟细胞中淀粉粒数量有所减少，但此阶段会有脂类物质出现。Bao等对分株紫萁（Linn. var.Fernald）卵发生进行了观察，发现卵细胞中造粉体中充满着形状不一的淀粉粒，但并未有孔区和典型卵膜的形成。本研究中，海金沙中多糖类和脂类物质出现时期以及动态变化基本与问荆类似，仅是淀粉数量及脂类含量略有差异。而其卵细胞呈现不典型卵膜的特征与分株紫萁相似，而孔区和分离腔的产生又类似于进化蕨类水蕨（（Linn.）Brongn.）。说明海金沙卵发生既具有原始蕨类的发育特征，又具有进化蕨类的发育特征。

综上所述，海金沙卵发生过程中卵细胞内的多糖类物质先增多再随发育逐渐减少，说明卵发生也是一个逐渐消耗能量的过程，腹沟和颈沟细胞的退化物质（多糖类和脂类物质）还为可能对精子具有吸引作用。卵细胞质膜处并没有糖类或脂类物质的积累。本研究从组织化学角度佐证了海金沙特殊的进化地位，即既有进化蕨类的卵发生特征（有孔区和分离腔形成），又有原始蕨类无典型卵膜的特征。