周中驰，徐志龙，陈学红，姜金晨，孙会刚

（徐州工程学院 食品与生物工程学院，江苏徐州 221018）

近年来，随着农药学、植物病理学和分子生物学等学科的迅速发展以及学科相互交融，植物源杀菌剂的研究开发取得了极大进步，包括抑菌活性成分的分析、作用方式和抑菌机理研究、抑菌谱和应用效果研究等[1]。开发天然、高效、安全、无毒、性能稳定、价格优惠和广泛适应环境的天然防腐剂已成为现代食品科学技术研究及其应用的一个重要热点。石榴叶和甘薯叶本身含有大量的活性抗菌物质，加快开发与利用石榴叶和甘薯叶，不仅可以有效减少资源浪费，还能有效降低天然抑菌剂价格，同时还能为我国天然抑菌剂提供新的来源。

石榴叶为石榴科石榴属植物石榴的叶子，具有清热燥湿、涩肠等功效。近年来，通过对石榴叶成分的分析，发现了30多种化合物，其中多酚类和黄酮类物质是石榴叶的主要功能性成分，可以作为抗真菌剂、抗生素、止血剂、杀寄生虫药使用。相比于维他命C、芦丁等物质，石榴叶提取物表现出更好的自由基清除能力及抗氧化活性。冯珍鸽等[2]使用索氏提取法以甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯为提取溶剂，对番石榴叶进行提取，确定最佳提取条件为甲醇、乙醇、正丁醇分别在料液比为1∶16，提取时间为5 h时，番石榴叶提取液最佳；乙酸乙酯在料液比为1∶18、提取时间为5 h时，番石榴叶提取液最佳，并对所提得的番石榴叶提取液进行抑菌实验，结果表明番石榴叶提取物有较强的抗菌活性。王红妹等[3]选取了石榴9个不同部位进行研究，用抑菌圈法测定各部位的抑菌活性，研究结果表明石榴叶、石榴皮、酸石榴籽为有效抑菌部位，具有一定的研究开发价值。

甘薯叶中含有多种营养成分且富含多种活性多糖、黄酮类化合物和绿原酸。绿原酸是通过咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经过莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，绿原酸具有多种生物活性[4-5]。苏萌萌等[6]用鸡肉腐败菌荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌作为指示菌，通过测量经过绿原酸处理前后细胞外的ATP和蛋白质质量浓度，并使用扫描电镜观察和激光扫描共聚焦显微镜观察指示菌经过绿原酸处理前后细胞膜的变化，说明绿原酸是通过作用于细胞膜，使细胞膜受损严重，导致膜电位被破坏，胞内大分子物质泄漏，从而达到抑菌作用。张鞍灵等[7]发现绿原酸具有抗氧化、抗菌、抗病毒作用；向国昌等[8]采用了浸提法、超声波法、浸提法加超声波法、传统水煎法和乙醇回流法等5种方法对甘薯叶中的绿原酸进行提取，并通过多种方法比较，发现最适合甘薯叶、茎中绿原酸提取的方法是浸提法和超声波法的综合使用，最佳提取条件是pH为4，提取溶液为50%的甲醇或乙醇，浸提时间为24 h，超声时间为1.0～1.5 h，温度为40 ℃。

由于石榴叶活性抗菌物质和甘薯叶活性抗菌物质都能被甲醇、乙醇等极性有机溶剂所提取，而且甲醇极性比乙醇大，更容易提取到所需的活性抗菌物质，故本实验将以甲醇作为提取溶剂。

1 材料与方法

1.1 原料

石榴叶，产地为广东省揭阳市；甘薯叶，产地为福建省漳州市。

1.2 指示菌种与试剂

细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），均为徐州工程学院生物芯片实验室保藏菌种；甲醇；LB培养基；肉汤琼脂培养基；枯草芽孢杆菌常用培养基；琼脂等。

1.3 主要仪器

SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；FA2140N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；HPX-16085H-Ⅲ恒温恒湿箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；303-1电热恒温培养，绍兴市银河机械仪器有限公司；KQ5200DE数控超声波清洗器，德国Christ公司；RE-2000B旋转蒸发器，上海亚荣生化有限公司；SH-Ⅲ型循环真空泵，上海亚荣生化有限公司；250 mL规格提取筒，江苏汇达医疗器械有限公司；250 mL规格蛇形冷凝管，江苏汇达医疗器械有限公司；立式高压蒸汽灭菌锅，日本Tomy Digital Biology公司等。

1.4 实验方法

1.4.1 石榴叶抑菌活性物质的提取

石榴叶清洗后烘干至恒重后，用粉碎机粉碎成粉，过50目筛。称取5 g石榴叶粉末，倒入已折好的滤纸包中，组装好索氏提取器，将滤纸包放入提取筒中，在提取筒里倒入100 mL甲醇，使甲醇能超过一次虹吸管，温度设置在80 ℃，回流萃取5 h。将原料的提取液放入旋转式蒸发器中，温度50 ℃，将提取液进行蒸发浓缩至25 mL，得到原液。

1.4.2 甘薯叶抑菌活性物质的提取

甘薯叶清洗后烘干至恒重，用粉碎机粉碎成粉，过50目筛。称取2 g甘薯叶粉末，加入200 mL浓度为50%的甲醇，在室温下静置24 h，放入超声波清洗器中，温度为40 ℃，时间为60 min，功率设置在80 W进行超声波提取。待原料提取完成后，将提取液进行抽滤，将滤液于旋转蒸发仪中，在温度为50 ℃下浓缩至10 mL，得到原液。

1.4.3 指示菌的活化

将保藏的4种指示菌接种于相应培养基进行活化，其中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌使用LB培养基进行培养，蜡样芽孢杆菌使用肉汤琼脂培养基进行培养，枯草芽孢杆菌使用枯草芽孢杆菌常用培养基进行培养，37 ℃培养24 h，然后挑选生长状况较好的菌落接入新的培养基上，重复进行上述步骤3次，从而得到生长良好的菌落，然后挑选生长状况较好的菌落各接入相应的液体培养基，放于摇床中37 ℃培养12 h后，取出备用。

1.4.4 抑菌实验

在无菌环境下，用生理盐水将4种指示菌液的浓度分别稀释为10-1、10-2、10-3和10-4，分别吸取100 μL 10-3、10-4浓度的菌液并滴加在相应的培养基上并涂布均匀，其中大肠杆菌菌液和金黄色葡萄球菌菌液滴加在LB培养基上，枯草芽孢杆菌菌液滴加在枯草芽孢杆菌常用培养基上，蜡样芽孢杆菌菌液滴加在肉汤琼脂培养基上。然后将直径为1 cm的打孔器在酒精灯的火焰上烧热灭菌，冷却后，在每个培养基上各打3个孔，分别注射200 μL的甘薯叶活性抑菌物质提取液、石榴叶活性抑菌物质提取液和无菌水，且将甘薯叶活性抑菌物质的提取液和石榴叶活性抑菌物质的提取液按照1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1的比例分别进行复配，同时培养基所打孔中注射的活性抑菌液为按以上的比例混合均匀的复配液，37 ℃恒温恒湿培养箱中培养18 h，观察抑菌效果并测量抑菌圈的直径。重复实验3次，取平均值。

2 结果与分析

由表1可知，抑菌液中仅甘薯叶提取物对枯草芽孢杆菌无抑菌效果，其余提取液均有抑菌效果，且石榴叶提取液的抑菌圈均大于甘薯叶提取液。当复配液为4∶6时，仅对大肠杆菌有最大的抑菌圈，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的抑菌圈直径均小于石榴叶提取液的抑菌圈，而当复配液比例为2∶8时，其对于4种指示菌的抑菌圈均大于石榴叶提取液的抑菌圈。表1所有抑菌液中甘薯叶提取液∶石榴叶提取液比例为2∶8复配液具有最佳的抑菌效果。

表1 不同种类提取液对供试菌种的抑菌圈直径（单位：cm）

3 结论

本实验表明了抑菌活性大小顺序为甘薯叶提取液∶石榴叶提取液比例为2∶8复配液＞石榴叶提取液＞甘薯叶提取液。由于本实验所用指示菌为常见的食品加工污染菌，故对植物源防腐剂的研发具有一定的意义。但要将石榴叶与甘薯叶的活性抗菌物质提取液应用到食品防腐上时，由于蒸发浓缩时不能保证甲醇完全被蒸发，而且甲醇对人体有危害，应将提取溶剂换为对人体危害小且提取效果相似的其他溶剂。