刘燕玲，李宛怡*，黄 昊，梁东明，麦旖旎

（1.南宁师范大学北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室，广西南宁530001；2.南宁市食品药品检验所，广西南宁 530001；3.南宁威耀供应链管理有限公司，广西南宁 530001；4.南宁海关技术中心，广西南宁 530001）

钙是人体生命活动中最重要的矿物元素之一，它参与人体新陈代谢、细胞的生长繁殖及生物大分子水平活动，因此钙是人体的生命之本[1]。随着技术的发展，市面上的补钙剂越来越多，国家市场监督管理总局公布的数据显示，补钙剂高达1 740种，批准使用的补钙剂保健品为896个，但无机钙与有机钙占市场比例较大。这些补钙剂生物利用低，对胃肠道的破坏性大。有研究表明第四代补钙剂纳米钙与前几代补钙剂相比具有较多优势[2-5]，如生物利用率高、钙量大、对胃肠的应激作用小，热稳定性好，特别适合一些老人、儿童及孕妇服用[6]。传统的纳米粒制备技术有分解与聚集两种方法，但这些方法需要精密、复杂的设备，并且损耗大量的能量，在应用上不方便、不经济，成本较高。近年来，受到生物矿化的启发，肽被用来作为生物模板在温和条件下合成铁、钙等矿物质纳米粒[7-9]。因此生物分子纳米钙有望成为新一代的补钙剂。在前期研究中，项目组已经探究了肽-钙纳米粒的形成条件[10]，热稳定性尚未有深入的研究。鲤鱼卵肽-钙纳米粒在121.1 ℃的高温下处理15 min后钙的保留率显著下降[7]。牡蛎肽-锌纳米粒在50 ℃的水浴中加热15 min后，发现其聚集沉淀，热稳定较差[11]。因此探究鮰鱼卵肽-钙纳米粒的稳定性是十分必要的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼卵肽，自制；食用明胶，河南佰荣生物科技有限公司；实验所用其他试剂均为分析纯以上。

1.2 仪器与设备

UV-201型紫外分光光度计，日本岛津公司；ME303E/02型电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；ST3100型实验室pH计，奥豪斯仪器常州有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；DJ1G型精密增力电动搅拌器，常州市金坛大地自动化仪器厂；ZHSY-50WS型水浴往复恒温振荡培养箱，厦门地坤科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 明胶对鮰鱼卵肽-钙纳米粒热稳定性的影响

称取一定量的明胶，在60 ℃的水浴锅加热溶解，使其初始浓度为1.5%、3.0%、4.5%。预先制备纳米粒分散液，准备3份等量的1%鱼卵肽溶液以1∶1的体积与15 mmol/L CaCl2混合摇匀，调节pH值为8.0，静止2 h，在600 nm测定其浊度为初始浊度。然后加入浓度为0%、1.5%、3.0%和4.5%的明胶（其终浓度为0%、0.5%、1.0%和1.5%）溶液混匀静置10 min测其浊度。将上述的鮰鱼卵肽-钙纳米颗粒-明胶体系在40～100 ℃加热15 min后冷却测其浊度，以室温浊度为标准，研究浊度随温度变化的情况。

1.3.2 明胶对鮰鱼卵肽-钙纳米粒形成的影响

参照黄海等[11]的方法略有修改，预先配制2.0%、4.0%、6.0%系列浓度明胶溶液，分别与10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L和50 mmol/L系列浓度氯化钙溶液以1∶1的体积混合均匀，再与1%的鮰鱼卵肽溶液以1∶1体积比混合（混合后体系中肽浓度为0.5%，明胶浓度分别为0%、0.5%、1.0%和1.5%，氯化钙浓度分别为2.5 mmol/L、5.0 mmol/L、7.5 mmol/L、10.0 mmol/L和12.5 mmol/L），每种混合溶液均调节pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，静置2 h后，在600 nm处测定浊度。

1.3.3 加热对明胶-鮰鱼卵肽-钙纳米粒的影响

选择上述几种能形成纳米粒的条件（固定鮰鱼卵肽浓度为5 g/L，氯化钙为7.5 mmol/L，pH 为8，分别在不加明胶、加0.5%明胶、1.0%明胶、1.5%明胶；当pH为7，不加明胶、加0.5%明胶、1.0%明胶、1.5%明胶）制备纳米粒分散液，并置于40～100 ℃水浴加热15 min，以未加热的初始浊度为标准，研究浊度随温度变化的情况。

1.3.4 数据处理

所有实验均做3个平行，运用SPSS统计软件进行方差分析和LSD检验。数据以均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 明胶对鮰鱼卵肽-钙纳米粒热稳定性影响

明胶可以作为一种食品添加剂添加到食品中，具有良好的增稠、增稳效果。其增稠的机理主要有两个方面，即胶束被改变与形成新的三维网络结构[12]。因此明胶也可作为食品添加剂加到鮰鱼卵肽-钙纳米粒中。当鮰鱼卵肽浓度为5 g/L、氯化钙为7.5 mmol/L、pH为8，形成鮰鱼卵肽-钙纳米粒后，在加热条件下观察0%明胶、0.5%明胶、1.0%明胶和1.5%明胶4种样液的浊度变化。如表1所示，鮰鱼卵肽-钙纳米粒在加热的作用下会失稳集聚甚至出现沉淀。出现聚集沉淀的原因可能是鮰鱼卵肽在加热的条件下发生了变性，导致其空间结构改变，钙离子结合能力下降，纳米粒失稳。大豆肽-钙复合物的受热性能却能达到80 ℃，一级结构稳定性强，蛋白发生变性的概率小。不加明胶加热的纳米粒在50℃以上开始发生沉淀，当加入0.5%、1.0%、1.5%明胶后，纳米粒的耐热性提高至60 ℃、70 ℃、80℃。因此明胶可以提高鮰鱼卵肽-钙纳米粒的热稳定性，浓度越高，耐热性越好，其原因可能是明胶具有增稠增黏的作用，可形成良好的保护膜。

表1 明胶对纳米粒热稳定性的影响

2.2 明胶对鮰鱼卵肽-钙纳米粒形成的影响

明胶可以显著提高鮰鱼卵肽-钙纳米粒热稳定性的前提是预先制备纳米粒，通过实验验证明胶对鮰鱼卵肽-钙纳米粒形成及热稳定性的影响。明胶参与鮰鱼卵肽钙-纳米粒的形成，如图1所示。明胶加入体系中，鮰鱼卵肽-钙纳米粒形成条件发生了改变。①从pH变化来讲，加入0.5%的明胶，鮰鱼卵肽-钙纳米粒的形成条件为10～12.5 mmol/L氯化钙浓度，pH 6～7。纳米粒的形成条件向着高pH的方向进行。随着明胶的加入，鮰鱼卵肽的等电点及带电量发生了改变，且体系的黏稠度增加使分子内摩擦阻力增加，分子流动性下降，需要pH调节反应体系的电荷平衡从而参与纳米颗粒的形成与稳定。②从氯化钙的浓度变化情况来看，加入0.5%的明胶，pH 6～7，10～12.5 mmol/L氯化钙浓度条件下，从不能形成纳米粒到能形成纳米粒。纳米粒的形成条件向着高浓度氯化钙的方向进行。加入明胶后，鮰鱼卵肽等电点提高至pH 4.0且带电量增加，肽分子间斥力增强，不利于肽分子的聚集。较高浓度的钙离子可以起到电荷屏蔽作用，并在其分子之间形成钙桥，促使其聚集成纳米粒。当体系中加入1.0%和1.5%的明胶，鮰鱼卵肽-钙纳米粒的形成条件也出现类似的变化趋势，且明胶的浓度越高，变化越明显。明胶是一种增稠剂，可以增加溶液的黏稠度，使分子内摩擦阻力增加，分子流动性下降，阻碍分子间的聚集，因此抑制纳米粒的形成，导致其形成条件范围发生改变。加入明胶后，鮰鱼卵肽-钙纳米粒形成需要较高的pH以及钙离子浓度。

图1 明胶对鮰鱼卵肽-钙纳米粒形成的影响

2.3 加热对明胶参与形成鮰鱼卵肽-钙纳米粒的影响

明胶能提高预先制备鮰鱼卵肽-钙纳米粒的热稳定性。明胶参与形成鮰鱼卵肽-钙纳米粒的热稳定性是否提高可通过以下实验进行验证。如表2所示，当pH为8，鮰鱼卵肽-钙纳米粒加热到50 ℃以上出现沉淀，0.5%、1.0%、1.5%明胶参与形成的纳米粒，耐热性分别达到60 ℃、70 ℃、80 ℃，耐热性显著增强了。如表3所示，pH为7，明胶参与形成的纳米粒耐热性增强，分别达到了60 ℃、70 ℃、80 ℃。明胶的增稠、增黏特性有效阻碍了纳米粒的集聚，使纳米粒的热稳定性提高，为其产业化发展奠定了基础。

表2 加热对明胶鮰鱼卵肽-钙纳米粒的影响（pH=8）

表3 加热对明胶鮰鱼卵肽-钙纳米粒的影响（pH=7）

3 结论

以浊度为评价指标，探究明胶对鮰鱼卵肽-钙纳米粒的形成及热稳定性的影响。鮰鱼卵肽-钙纳米粒在50 ℃加热的作用下会失稳集聚出现沉淀。在纳米粒中加入0.5%、1.0%、1.5%明胶后，纳米粒的耐热性提高至60 ℃、70 ℃、80 ℃。明胶对鮰鱼卵肽-钙纳米粒的形成具有抑制作用，导致其形成纳米粒需要更高的pH和氯化钙浓度。明胶参与形成的纳米粒的耐热性显著提高。