李乐乐，杨学为，罗雪韵，范 柳，尹乐斌,2*

（1.邵阳学院 食品与化学工程学院，湖南邵阳 422000；2.豆制品加工与安全控制湖南省重点实验室，湖南邵阳 422000）

豆渣是豆制品加工副产物，其富含膳食纤维、有机酸和蛋白质等营养成分。由于豆渣有机物丰富，水分大且口感粗糙，导致其处理成本高昂，豆渣的综合利用也成为豆制品企业急需解决的问题[1]。大豆多肽即肽基蛋白水解物，其主要是通过酶解和微生物发酵使大分子蛋白水解为小分子多肽，研究表明大豆多肽具有抗氧化、降血压、降血糖和抗疲劳等生理活性[2-4]。不同分子量大豆多肽生理活性也存在差异。邓成萍等[5]运用中性蛋白酶和碱性蛋白酶双酶水解制备大豆多肽，并超滤分离成4个多肽组分，同时探究不同分子量多肽的物理性质和生物活性，研究发现小分子大豆多肽的DPPH自由基清除能力和ACE抑制活性显著增强。

超滤分离是一种应用广泛的膜分离技术，在压力差作用下利用超滤膜将不同分子量物质分离，具备操作简单、成本低、适应力强等优势，通常被用于分离纯化多肽、多糖等活性成分[6]。豆渣经枯草芽孢杆菌发酵制备大豆多肽，其发酵液颜色较深。本实验利用活性炭对发酵液进行脱色处理，超滤分离纯化不同组分多肽，并对其抗氧化活性进行比较分析，以深入了解不同组分多肽的生理活性，同时为探究大豆多肽的纯化技术提供有效的指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与菌株

豆渣由实验室提供；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），绿陇生物有限公司。

1.1.2 试剂

活性炭，台山市粤侨试剂塑料有限公司；ABTS，分析纯，安徽酷儿生物工程有限公司；DPPH，分析纯，南京都莱生物技术有限公司；抗坏血酸，福晨化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备

SCIENTZ-10N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；VELOCITY 14R台式冷冻离心机，Dynamica公司；D-7型紫外分光光度计，南京菲勒仪器有限公司；微滤机组，使用纤维膜和不同分子量的超滤膜，上海摩速科学器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆多肽的制备

回收干净的湿豆渣利用精细磨粉碎成糊浆状，加入纯化水调整豆渣的干基使其达到5.8%，在豆渣糊中加入纤维素酶水解形成豆渣酶解液，将其置于80 ℃水浴锅灭酶10 min（将pH值调整为7.2）。将枯草芽孢杆菌接种在豆渣酶解液中开始液态发酵（控制发酵条件为温度37 ℃，接种量3%，时间60 h），将发酵液在冷冻离心机下以10 000 r/min离心10 min后取上清液保存备用。

1.2.2 活性炭脱色处理

由于豆渣发酵液颜色呈黄褐色，因此考虑利用活性炭进行脱色处理。量取20 mL发酵液置于锥形瓶中，在一定的活性炭用量（0.25%、0.50%、1.00%、1.50%和2.00%）、脱色温度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃）、脱色 时 间（15 min、30 min、45 min、60 min和75 min）下对豆渣发酵液进行脱色处理，脱色液经抽滤和离心后，在400 nm波长下测定脱色前后吸光度变化，在540 nm波长下测定脱色前后多肽含量变化，以脱色率和多肽保留率为指标，确定最佳脱色条件。脱色率和多肽保留率计算公式如下：

式中：A1为脱色前吸光度；A2为脱色后吸光度；B为脱色后多肽含量，%；B0为脱色前多肽含量，%。

1.2.3 超滤分离

将脱色处理后的发酵液进行冷冻离心（5 200 r/min，12 min），分别通过预先清洗的纤维膜和10 kDa、5 kDa、3 kDa和500 Da的超滤膜，压力调整为40 MPa，25 ℃下进行回流超滤。发酵液最初体积为4 000 mL，起初将发酵液通过含有纤维膜的柱子以除去其中的不溶性杂质，然后由大到小经过10 kDa、5 kDa、 3 kDa、500 Da超滤膜，分阶段收集5～10 kDa、3～5 kDa、500～3 000 Da和＜500 Da的组分，将不同组分样品进行冷冻干燥，冻干粉置于-20 ℃保存备用。

本课题的前期实践研究阶段已告一段落，在前期实践研究中各教研组扎实的开展课例研讨活动、学校举办了青年教师赛课活动，本课题小组通过这一系列的活动收集到与课题相关的课例小结、课堂实录、教学反思以及经验论文等资料，已取得部分的成效，现将研究情况报告如下。

1.2.4 多肽的抗氧化性

测定不同多肽组分的ABTS阳离子清除率、DPPH自由基清除率、OH自由基清除率[7-8]。根据不同自由基在不同波长下存在特征吸收峰确定波长，由于自由基与抗氧化剂共存时，其体系溶液颜色变浅，故可以用于判定多肽样品的抗氧化能力，根据不同波长下样品的吸光度值即可得到不同自由基的清除率。

2 结果与分析

2.1 活性炭脱色处理

2.1.1 脱色温度对发酵液脱色效果的影响

如图1所示，随着脱色温度提高，发酵液脱色率呈先快速上升后趋于缓慢下降的趋势，多肽保留率呈先急剧下降后缓慢下降得趋势，当脱色温度低于50 ℃时，随着温度升高，发酵液脱色率快速升高且多肽保留率下降明显，当温度超过50 ℃时，脱色率和多肽保留率缓慢降低，可能是由于温度升高，体系中分子加快扩散，加速了活性炭对色素及其他分子的吸附，但当温度过高，会使活性炭的解吸大于吸附，同时也会使部分活性成分损失[9]。综合考虑，选择脱色温度50 ℃为最佳。

图1 脱色温度对发酵液脱色效果的影响

2.1.2 脱色时间对发酵液脱色效果的影响

如图2所示，随着脱色时间的延长，发酵液脱色率呈先快速上升后趋于平缓的趋势，多肽保留率呈先急剧下降后趋于平稳的趋势，当脱色时间＞45 min，发酵液脱色率和多肽保留率相对稳定，这是由于活性炭吸附存在吸附和解析的动态平衡，在脱色时间45 min时到达了平衡点。综合考虑，选择脱色时间45 min为最佳。

图2 脱色时间对发酵液脱色效果的影响

2.1.3 活性炭添加量对发酵液脱色效果的影响

图3 活性炭添加量对发酵液脱色效果的影响

2.2 抗氧化能力测定

2.2.1 ABTS阳离子清除率测定

ABTS与过硫酸钾反应，生成蓝绿色的ABTS自由基在734 nm处有特征吸收峰，当与抗氧化剂共存时，体系颜色变浅，在734 nm处的吸光度下降，因其反应灵敏、操作简便而被广泛应用于抗氧化活性指标的评定[10]。不同多肽组分对ABTS阳离子清除效果如图4所示，发酵液的不同超滤组分样品均具有一定的清除效果，＜500 Da的多肽样品比其他组分对ABTS阳离子清除效果强。

图4 不同多肽组分对ABTS阳离子 清除效果

2.2.2 DPPH自由基清除率测定

DPPH是一种稳定的自由基，由于其具有单电子，其醇溶液在517 nm具有明显的吸收峰，当DPPH中单电子与其他抗氧化剂中的单电子配对时，517 nm处吸光度降低，因此常被用来分析体外抗氧化实验[10]。不同多肽组分对DPPH自由基清除效果如图5所示，发酵液的不同超滤组分样品对DPPH自由基都具有一定的清除效果，其中5～10 kDa的多肽样品比其他组分清除效果强。

图5 不同多肽组分对DPPH的清除效果

2.2.3 OH自由基清除率测定

OH自由基是活性氧中对生物体毒害作用最强的一种自由基，与细胞衰老和损伤有关[11]。不同多肽组分对OH自由基清除效果如图6所示，发酵液的不同超滤组分样品对OH自由基都具有一定的清除效果，其中3～5 kDa的多肽样品比其他组分清除效果强。

图6 不同多肽组分对OH的清除效果

3 结论

本研究利用枯草芽孢杆菌发酵豆渣酶解液制备大豆多肽，利用活性炭脱色处理，再通过超滤分离不同组分多肽，并研究不同组分的抗氧化能力。结果表明，最佳脱色条件为活性炭添加量1%、脱色温度50 ℃、脱色时间45 min；不同组分对3种自由基均有一定的清除活性，其中＜500 Da多肽组分对ABTS阳离子自由基清除活性最强，5～10 kDa多肽组分对DPPH自由基清除活性最强，3～5 kDa对OH自由基清除活性最强。本研究为探究大豆多肽生理活性和开发前景提供数据参考。