李亚南 金春明 宫方岩 高 宇 邓 梦 张 航 丁鑫哲 尹贵彬

1.牡丹江医学院第一临床医学院，黑龙江牡丹江 157000；2.牡丹江医学院附属红旗医院检验科，黑龙江牡丹江 157000

乳腺癌居女性恶性肿瘤发病率首位，也是女性患癌死亡的主要原因[1]。有研究表明，患有良性乳腺疾病的女性， 在长达15年的时间里都有较高的转为乳腺癌的风险[2]。MicroRNA（miR）是一种调控分子，可监督各种过程和基因表达，miR 可以通过干扰细胞活动来正向或负向调节乳腺肿瘤形成[3]，因此，miR 显示出了其用作监测乳腺癌的生物标志属性。近年国内外研究表明，miR-501-5p 通过多种信号通路在多种癌症中起重要作用，但在乳腺癌中的作用尚未发现。 哺乳动物LAMTOR5 是一种高度保真的、约18 kDa 的蛋白，其最初被鉴定为乙型肝炎X 蛋白相互作用蛋白（hepatitis B virus X -interacting protein，HBXIP）[4]。LAMTOR5 与致癌基因c-Myc、p53、survivin 相关，可发挥促进癌细胞增殖及抗凋亡作用[5-7]。 miR-501-5p与LAMTOR5 两者间相关性尚未有研究发现。 本研究旨在通过探讨miR-501-5p 在乳腺癌患者组织及血清中的表达水平、LAMTOR5 在乳腺癌组织和癌旁组织中的差异表达以及miR-501-5p 与LAMTOR5 之间的相关性，为乳腺癌的早期临床诊断提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年3月至2021年3月牡丹江市肿瘤医院收治的40 例初次诊断为乳腺癌的患者为乳腺癌组，收集其初次手术切除的癌组织、癌旁组织及血清，选取同期在牡丹江市牡丹江医学院附属红旗医院体检的40 名体检者为健康对照组，采集其血清。新鲜组织标本于液氮中转运，保存于-80℃冰箱。乳腺癌组中，平均年龄（54.15±10.99）岁；健康对照组均为女性，平均年龄（53.13±8.09）岁，两组的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 本研究经医院伦理委员会审核批准且所有患者及家属均签署知情同意书。

纳入标准：①所有乳腺癌患者首次经病理组织活检诊断为原发性乳腺癌；②乳腺癌患者手术切除病灶前未接受放疗及化疗等治疗措施；③乳腺癌患者临床病历资料完备； ④健康体检者过去3 个月无癌症史，无住院治疗记录，无其他良性乳腺疾病；⑤健康体检者未处于孕期或哺乳状态。

排除标准： ①患有其他慢性疾病及其他肿瘤患者；②非女性患者。

临床数据癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）表达水平、糖类抗原153（carbohydrate antigen，CA153）表达水平、糖类抗原125（carbohydrate antigen，CA125）表达水平、人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）表达情况、雌激素受体（estrogen receptor，ER）表达情况、孕激素受体（progesterone receptor，PR）表达情况来自医院病理数据。

1.2 主要试剂及设备

Trizol 总RNA 提取试剂（批号：Lot20210525C）、miR-501-5p SYBR 两步法试剂盒（批号：Lot20210625）均购自上海艾博思生物科技有限公司；PCR 仪（型号：MX3000P）购自美国Aligent Stratagene 公司；LAMTOR5抗体（货号：14492-1-AP）购自武汉三鹰生物有限公司；脱水机（型号：JT-12J）、包埋机（型号：JB-L5）购自武汉俊杰电子有限公司；显微镜（型号：eclipse Ci-e）购自日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 MiR-501-5p 检测 实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）法检测乳腺癌组织、癌旁组织、 实验组血清及对照组血清中miR-501-5p 水平，先经总RNA 提取试剂盒（Trizol 法）提取血清总RNA， 经反转录试剂盒转录为cDNA， 再进行qRTPCR 反应。 qRT-PCR 反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性20 s，62℃退火40 s，72℃延伸40 s，共40 个循环，采用2-△CCT计算miR-501-5p 表达量。

1.3.2 LAMTOR5 定性检测 采用免疫组织化学技术定性检测乳腺癌组织及癌旁组织中LAMTOR5 表达情况。 组织制成切片后烘干，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、3%过氧化氢水溶液中孵育、PBS 洗涤3 次， 再将切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液中修复抗原、PBS 洗涤滴加封闭液后室温封闭。 滴加一抗， 阴性对照以PBS 代替，切片置于湿盒内4℃孵育过夜。 PBS 洗涤、滴加二抗，室温孵育。 PBS 洗涤后滴加DAB 显色液，显微镜下观察显色情况，见棕黄色即蒸馏水冲洗切片终止染色。 苏木精复染3 min、盐酸酒精分化、蒸馏水冲洗、梯度乙醇脱水、中性树胶封片。

1.4 观察指标及评价标准

①比较乳腺癌患者癌组织与癌旁组织的miR-501-5p 表达水平；②比较乳腺癌组和健康对照组的血清miR-501-5p、CEA、CA153、CA125 表达水平；③比较不同临床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 的表达水平；④LAMTOR5 在乳腺癌组织和癌旁组织中表达情况；⑤LAMTOR5 和miR-501-5p 在乳腺癌组织中表达的相关性；⑥判断miR-501-5p 的诊断效能，绘制ROC 曲线，ROC 曲线是反映敏感性和特异性连续变量的指标， 以敏感度为纵坐标，（1-特异度）为横坐标绘制成曲线，AUC 越接近1，诊断准确性越高。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman 检验； 绘制ROC 曲线判断miR-501-5p 的诊断效能；以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与癌旁组织中miR-501-5p 表达水平的比较

miR-501-5p 在乳腺癌组织中的表达水平为（1.12±0.23），在癌旁组织中的表达水平为（0.96±0.15），其在乳腺癌组织中的表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）（图1）。

图1 乳腺癌组织与癌旁组织中MiR-501-5p 表达水平的比较

2.2 乳腺癌组与健康对照组血清中miR-501-5p 表达水平的比较

乳腺癌组血清中miR-501-5p 的表达水平为（0.96±0.17），健康对照组血清中miR-501-5p 的表达水平为（0.88±0.12），乳腺癌患者血清中miR-501-5p的表达水平高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（图2）。

图2 乳腺癌组与健康对照组血清中miR-501-5p 表达水平的比较

2.3 乳腺癌组与健康对照组血清肿瘤标志物表达水平的比较

乳腺癌组血清中CEA、CA153、CA125 表达水平高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 乳腺癌组与健康对照组血清肿瘤标志物表达水平的比较（±s）

表1 乳腺癌组与健康对照组血清肿瘤标志物表达水平的比较（±s）

注 CEA：癌胚抗原；CA153：糖类抗原153；CA125：糖类抗原125

乳腺癌组健康对照组t 值P 值40 40 4.33±4.72 1.21±0.65 4.182＜0.001 25.31±48.35 9.06±5.10 2.114 0.041 29.17±49.59 10.90±2.95 2.326 0.025组别 例数 CEA（ng/ml） CA153（U/ml）CA125（U/ml）

2.4 不同临床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 表达水平的比较

miR-501-5p 在淋巴结转移、TNM 分期Ⅲ、 Ⅳ期患者中的表达水平高于未发生淋巴结转移、TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期患者，差异有统计学意义（P<0.05）。 乳腺癌患者不同年龄、Her-2、ER、PR 表达情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

表2 不同临床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 表达水平的比较（±s）

表2 不同临床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 表达水平的比较（±s）

注 ER：雌激素受体；PR：孕激素受体；Her-2：人类表皮生长因子受体2

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2.5 LAMTOR5 在乳腺癌组织和癌旁组织中表达情况的比较

运用免疫组化技术检测LAMTOR5 在癌组织及癌旁组织中的表达情况，LAMTOR5 主要在细胞质中表达，染色呈棕黄色为阳性（图3）。LAMTOR5 在乳腺癌组织中的阳性表达率为77.5%，高于癌旁组织的阳性率15.0%，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

图3 LAMTOR5 在乳腺癌组织中的表达情况

表3 LAMTOR5 在乳腺癌组织及癌旁组织中表达情况的比较[n（%）]

2.6 MiR-501-5p 表达水平与LAMTOR5 表达情况的相关性

通过Spearman 相关性分析发现，miR-501-5p 在乳腺癌组织中的表达水平与LAMTOR5 的阳性表达呈正相关（P＜0.05）（表4）。

表4 miR-501-5p 表达水平与LAMTOR5 表达情况的相关性

2.7 ROC曲线分析血清中CEA、CA153、CA125、miR-501-5p 在乳腺癌中的诊断价值

为进一步判断CEA、CA153、CA125 及miR-501-5p 四者对乳腺癌的检验诊断效能，用ROC 曲线对四项指标进行分析，结果见图4、表5。 在四项指标中，CEA 的AUC 最大，CEA、CA153、CA125 及miR-501-5p 四项联合的AUC 大于CEA、CA153 及CA125 三项联合诊断。

表5 CEA、CA153、CA125、miR-501-5p 在乳腺癌中的诊断效能

图4 血清中CEA、CA153、CA125、miR-501-5p 诊断乳腺癌中的ROC 曲线图

3 讨论

据估计，2020年全球发生了1930 万新癌症病例，近1000 万癌症死亡病例，其中女性乳腺癌已经超过肺癌——成为最常被诊断出的癌症，约230 万[8]。乳腺癌的早发现、早诊断是提高乳腺癌患者生存率的重要因素之一。 手术治疗、药物治疗及辅助放疗等治疗手段的逐渐成熟，提高了早期发现患者的生存率。

癌基因和抑癌基因的改变决定了癌症的发生，这些基因表达可以通过miR 进行调控[9]。 自2002年发现肿瘤抑制性miR 以来， 先后发现多种miR 的失调参与肿瘤发生的启动，癌症的进展、侵袭和转移，其中也包括乳腺癌[10]。 本研究的主要研究对象miR-501-5p 是一种有多种调控作用的非编码RNA， 可以与多种靶mRNA 的3’非编码区（3’UTR）结合，调节细胞内多种通路以达到致癌作用[11-12]。 本研究采用qRTPCR 技术检测了miR-501-5p 的表达情况，乳腺癌组织中miR-501-5p 表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；乳腺癌患者血清中miR-501-5p表达水平高于健康对照人群血清，差异有统计学意义（P＜0.05）。 提示miR-501-5p 在乳腺癌的发生发展中可能起到了致癌作用，可以作为一个潜在的乳腺癌血清学肿瘤标志物。 为进一步了解miR-501-5p 的作用机制， 结合其与乳腺癌临床病理特征间关系发现，其表达与淋巴结转移及乳腺癌临床TNM 分期有关（P＜0.05），与年龄、ER、PR、Her-2 表达均无关（P＞0.05），淋巴结转移和临床TNM 分期是提示患者预后不良的指标，miR-501-5p 的表达水平随着临床TNM 分期的增加而增加且随着淋巴结转移而增加， 这表明miR-501-5p 的高表达可能提示患者乳腺癌病程深甚至发生转移。大量文献表明，多种肿瘤标志物的联合检测，可以提高乳腺癌的检出率、降低误诊率[13-14]，再配合影像学检查，将大大提高乳腺癌的诊断准确性[15-16]。本研究发现，miR-501-5p 与传统血清学肿瘤标志物CEA、CA153、CA125 四项联合检测的诊断效能明显高于各项单独诊断乳腺癌的效能，同时也高于CEA、CA153、CA125 三者联合诊断乳腺癌的诊断效能，这提示四者有望成为一种新的乳腺癌早期诊断标志物组合。

LAMTOR5 在多种癌症中高表达， 大量研究均表示其与一系列临床病理特征和不良预后相关[17-20]。 本研究运用免疫组化法对癌组织中LAMTOR5 的表达进行分析，癌组织中的LAMTOR5 阳性表达率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）,提示其对乳腺癌的发生发展有作用，且miR-501-5p 与LAMTOR5的表达呈正相关， 提示miR-501-5p 可能通过靶向LAMTOR5 对乳腺癌的发生发展起到正向调节作用，但具体靶向方式还有待在日后的研究中加以证实。

综上所述，miR-501-5p 和LAMTOR5 在乳腺癌中可能起致癌作用。本研究不足之处在于总标本量较小， 且仅初步研究了miR-501-5p 和LAMTOR5 在实验组及对照组中的差异表达， 未进一步研究miR-501-5p 与其靶标LAMTOR5 的具体作用机制。 若能深入研究两者的作用方式，miR-501-5p 及LAMTOR5可能为乳腺癌的早期发现及治疗提供新思路。